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作者

侯晓

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

张开刚

学位年度

2015

学位授予单位

泰山医学院

关键词

骨肉瘤 Notch-1通道阻断剂 血管生成 疗效评价

分类号

R738.1;R730.53

摘要

背景：<br> 骨肉瘤（osteosarcoma）是恶性程度较高的间叶组织来源骨肿瘤，多发生于青少年，恶性程度较高，目前主流的治疗手段包括新辅助化疗联合外科手术治疗，但是由于肿瘤复发、早期的肺转移以及放化疗的毒副作用使得其五年生存率没有明显的提高，因此需要新的治疗手段来弥补传统治疗方法的不足。抗肿瘤血管生成治疗是极具潜力的靶向治疗手段，通过抑制肿瘤血管的生存达到抑制肿瘤生长、浸润基远处转移的目的，由于其作用准确，不影响正常组织的血管生长，因此是目前研究的新热点。<br> Notch信号转导通路是一项最新发现的与肿瘤血管发生有关的信号通路，其在肿瘤的发生及发展过程中起着双重作用，目前已有多项研究证实阻断Notch通路可以明显抑制皮肤癌、肝癌、胃肠道肿瘤以及宫颈癌、乳腺癌的发展及浸润转移，但在骨肉瘤的血管生成方面研究较少，因此我们的研究关注于Notch信号通路与骨肉瘤的发生和发展的关系以及其发挥作用的靶向通路，从而为利用Notch通路达到治疗骨肉瘤的目的提高理论依据及可行性，进而改善目前的骨肉瘤治疗手段。<br> 目的：<br> 研究Notc...更多

背景：<br> 骨肉瘤（osteosarcoma）是恶性程度较高的间叶组织来源骨肿瘤，多发生于青少年，恶性程度较高，目前主流的治疗手段包括新辅助化疗联合外科手术治疗，但是由于肿瘤复发、早期的肺转移以及放化疗的毒副作用使得其五年生存率没有明显的提高，因此需要新的治疗手段来弥补传统治疗方法的不足。抗肿瘤血管生成治疗是极具潜力的靶向治疗手段，通过抑制肿瘤血管的生存达到抑制肿瘤生长、浸润基远处转移的目的，由于其作用准确，不影响正常组织的血管生长，因此是目前研究的新热点。<br> Notch信号转导通路是一项最新发现的与肿瘤血管发生有关的信号通路，其在肿瘤的发生及发展过程中起着双重作用，目前已有多项研究证实阻断Notch通路可以明显抑制皮肤癌、肝癌、胃肠道肿瘤以及宫颈癌、乳腺癌的发展及浸润转移，但在骨肉瘤的血管生成方面研究较少，因此我们的研究关注于Notch信号通路与骨肉瘤的发生和发展的关系以及其发挥作用的靶向通路，从而为利用Notch通路达到治疗骨肉瘤的目的提高理论依据及可行性，进而改善目前的骨肉瘤治疗手段。<br> 目的：<br> 研究Notch-1通道阻断剂GSI在抑制小鼠骨肉瘤模型中肿瘤增长、细胞因子分泌等方面的影响，以及其抑制肿瘤血管生成作用，进而探讨Notchl信号通路在小鼠骨肉瘤模型中的作用及其作用机制。为将来利用GSI对小鼠乃至人骨肉瘤的治疗作用奠定实验和理论基础。<br> 方法：<br> 1、实验流程<br> 1.1MG-63细胞的培养与传代<br> MG-63骨肉瘤细胞在37℃、5％CO2饱和度的细胞培养箱中培养，培养液为含10%的灭活胎牛血清、青霉素100IU/ml和链霉素100ug/ml的DMEM细胞培养基，每48h换液。<br> 1.2人骨肉瘤荷瘤SCID小鼠模型的建立<br> （1）饲养重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠40只，通过皮下注射人骨肉瘤细胞株MG-63细胞建立不同异体移植动物模型。左后肢皮下注射2×107个MG-63细胞，右后肢同部位注射PBS溶液作阴性对照。<br> （2）观察观察荷瘤后小鼠的生长状态及生物学特性的不同。每日监测小鼠的体重、皮毛、活动情况、有无麻痹瘫痪症状和感染迹象等。经皮下注射的小鼠还需测量皮下瘤块的体积(ab2π/6，a为长径，b为短径)。<br> 1.3研究阻断Notch通路对骨肉瘤血管生成、肿瘤增长及侵袭的作用。<br> 1.3.1应用Notch通路阻断剂GSI瘤内注射，观测阻断Notch通路对肿瘤增长的影响。<br> 将荷瘤成功后小鼠随机分为三组，实验组肿瘤内注射Notch通路阻断药物GSI（γ-分泌酶抑制剂，以DMSO作溶剂），每日1次，连续5天，对照组分别注射DMSO及PBS，每日监测小鼠的体重、皮毛、活动情况、有无麻痹瘫痪症状和感染迹象等。经皮下注射的小鼠还需测量皮下瘤块的体积(ab2π/6，a为长径，b为短径)。<br> 1.3.2肿瘤组织及转移组织免疫组织化学方法检测Notch-1、MMP-2及MMP-9表达及定位，同时检测微血管密度（MVD）的表达情况与差异。<br> 分离、摘除小鼠皮下瘤块，用10%甲醛固定、石蜡包埋并进行苏木精-伊红染色；免疫组织化学方法检测Notch-1、MMP-2及MMP-9蛋白表达。病理标本进行微血管密度(MVD)的检测：使用兔抗小鼠CD31抗体标记内皮细胞，然后计数微血管。首先在100倍显微镜下选取血管密度较高的区域(“热点”)，然后在400倍显微镜下进行拍照，并用图像分析软件分析计数微血管数。<br> 1.3.3探讨阻断Notch通路对骨肉瘤血管生成、肿瘤增长及侵袭的作用及其分子机制。<br> 2、统计学分析<br> 采用SPSS软件，行配对t检验、单样本t检验、秩和检验，统计分析。<br> 结果：<br> 1、MG-63细胞的生长形态<br> MG-63细胞在倒置显微镜下为长梭形，贴壁生长，传代时间约为2d。<br> 2、SCID裸鼠肿瘤模型成瘤性<br> 成功建立MG-63骨肉瘤细胞系SCID小鼠骨肉瘤生长模型，40只SCID小鼠中进行左后肢皮下接种 MG-63细胞，荷瘤成功标准为皮下肿瘤结节长径大于0.5cm，36只小鼠在荷瘤实验2周后出现皮下结节形成，结节逐渐增大，到40天时均达到荷瘤成功标准（皮下肿瘤平均长径为：6.348mm，平均短径为：5.576mm，平均体积为：103.34mm3），荷瘤成功率90%。<br> 3、荷瘤成功后SCID小鼠生物学变化<br> 所有小鼠在荷瘤实验后进行生物学指标观察，包括小鼠的体重、饮食、睡眠、运动情况、精神状态、对刺激的反应及小鼠的皮毛光泽度等等，接种后3周时见荷瘤小鼠步态迟缓，目光呆滞，体型消瘦，反应迟钝，但未见死亡及明显感染症状。同荷瘤失败小鼠相比较，荷瘤成功小鼠的体重随肿瘤体积增大及天数延长逐渐减轻，同时性情变得狂躁，常常出现互相撕咬情况，小鼠的饮食量较少，睡眠时间明显缩短，对刺激的反应性也有不同程度的下降。<br> 4、GSI治疗效果评价<br> 4.1小鼠生物学指标观测<br> 同对照组相比，GSI治疗组小鼠的生物学指标明显较好，其小鼠的体重、饮食、睡眠、运动情况、精神状态、对刺激的反应及小鼠的皮毛光泽度等优于对照组，其皮下肿瘤体积增长缓慢，实验组平均体积为（149.29mm3）较DMSO对照组平均体积（572.88mm3）及PBS对照组平均体积（492.06mm3）明显缩小，其差别具有统计学意义，P<0.05。<br> 4.2肿瘤的病理学评价<br> 将小鼠瘤体切片后进行免疫组化染色，实验组及对照组内瘤体切片内均见Notch-1、MMP-2及MMP-9表达，其中Notch-1表达于细胞质和细胞膜，呈棕黄色染色，MMP-2及MMP-9表达于胞浆内或胞膜出现黄染颗粒,呈棕黄色，与对照组相比实验组Notch-1、MMP-2及MMP-9表达均明显降低。实验组及PBS、DMSO对照组Notchl平均秩次分别为5.56、31.2和29.3，实验组及PBS、DMSO对照组MMP-2平均秩次分别为4.55、22.1和24.5，实验组及PBS、DMSO对照组MMP-9平均秩次分别为3.59、26.3和27.8。<br> 实验组及对照组内瘤体切片内血管均见不同程度的CD31表达，其表达于血管内皮细胞内，与对照组相比实验组CD31表达均明显降低，实验组及PBS、DMSO对照组CD31平均秩次分别为4.03、28.8和32.5。<br> 结论：<br> 1、通过SCID小鼠骨肉瘤动物模型证实GSI可下调Notch信号通路中Notchl的表达和MMP-2、MMP-9等分子表达。<br> 2、GSI对SCID小鼠骨肉瘤动物模型的治疗作用通过抑制Notch通路进而干预肿瘤血管形成来实现的。<br> 3、应用GSI阻断Notch信号通路有望成为骨肉瘤抗肿瘤治疗的新靶点。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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