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作者

刘艺

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

宋文刚，唐华

学位年度

2014

学位授予单位

泰山医学院

关键词

巨噬细胞 DC 抗原传递 CD4+T 细胞免疫反应

分类号

R392

摘要

目的以当前国内外尚未深入探讨的体内巨噬细胞和树突状细胞在免疫反应中的相互作用的研究现状为契机，以现代细胞免疫学和分子免疫学方法为研究手段。联合应用Baft3-/-和CX3CR1GFP/GFP等各种缺陷鼠模型，研究脾脏巨噬细胞和树突状细胞在抗原诱导的CD4+T细胞免疫反应中的作用，为阐明体内专职抗原提呈细胞参与和调节特异性免疫应答的机理提供一定的理论基础。方法1. C57BL/6小鼠胸腺单细胞悬液经20Gy X射线辐照诱导凋亡后，10mg/ml的OVA VI级蛋白及含有1%BSA1640培养基37℃孵育4h，制备细胞相关抗原。2. C57BL/6小鼠尾静脉回输标记有e450荧光染料的CD45.1细胞相关抗原，1h后处死小鼠，制备脾脏单细胞悬液；同时留取脾脏组织进行冰冻切片。通过FACS及免疫组织荧光染色分析小鼠脾脏内吞噬细胞吞噬抗原的能力。3. C57BL/6小鼠尾静脉注射脂质体（200ul/只）后day1、5、12的前一日尾静脉回输106个CD45.1与OT II杂交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T细胞（标记e450），并于当日尾静脉回输细胞相关抗原，同时设正常C57BL/6小鼠为正常...更多

目的以当前国内外尚未深入探讨的体内巨噬细胞和树突状细胞在免疫反应中的相互作用的研究现状为契机，以现代细胞免疫学和分子免疫学方法为研究手段。联合应用Baft3-/-和CX3CR1GFP/GFP等各种缺陷鼠模型，研究脾脏巨噬细胞和树突状细胞在抗原诱导的CD4+T细胞免疫反应中的作用，为阐明体内专职抗原提呈细胞参与和调节特异性免疫应答的机理提供一定的理论基础。方法1. C57BL/6小鼠胸腺单细胞悬液经20Gy X射线辐照诱导凋亡后，10mg/ml的OVA VI级蛋白及含有1%BSA1640培养基37℃孵育4h，制备细胞相关抗原。2. C57BL/6小鼠尾静脉回输标记有e450荧光染料的CD45.1细胞相关抗原，1h后处死小鼠，制备脾脏单细胞悬液；同时留取脾脏组织进行冰冻切片。通过FACS及免疫组织荧光染色分析小鼠脾脏内吞噬细胞吞噬抗原的能力。3. C57BL/6小鼠尾静脉注射脂质体（200ul/只）后day1、5、12的前一日尾静脉回输106个CD45.1与OT II杂交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T细胞（标记e450），并于当日尾静脉回输细胞相关抗原，同时设正常C57BL/6小鼠为正常对照组，3d后检测CD4+CD45.1+T细胞增殖比例、e450分裂峰及细胞绝对计数。4. Batf3-/-转基因小鼠尾静脉回输CD45.1与OT II杂交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T细胞，次日尾静脉回输细胞相关抗原，同时设正常C57BL/6小鼠为正常对照组，3d后检测CD4+CD45.1+的增殖比例及细胞绝对计数。5. C57BL/6小鼠尾静脉回输细胞相关抗原1h后分选其脾脏巨噬细胞及DC，同时分选OT II小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T细胞（标记e450），进行巨噬细胞与T细胞，DC与T细胞，巨噬细胞、DC共同与T细胞体外共培养，96h后检测T细胞的增殖。6.分选回输细胞相关抗原（标记e450）1h后的脾脏巨噬细胞与Naive小鼠的脾脏DC共培养，分别于1h、3h、4h、5h，FACS检测巨噬细胞向DC传递细胞相关抗原（e450+）的能力。7.分选回输细胞相关抗原（标记e450）1h后的脾脏巨噬细胞，Naive小鼠的脾脏DC以及DC、巨噬细胞共同与T细胞共培养3d后，检测CD4+CD45.1+的增殖比例和e450的分裂峰。8. C57BL/6小鼠尾静脉回输CD45.1与OT II杂交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T细胞（标记e450），次日腹腔注射G蛋白偶联受体抑制剂百日咳毒素（PTx)500ng/只，8h后尾静脉回输细胞相关抗原，同时再次腹腔注射百日咳毒素（PTx)500ng/只，同时设正常C57BL/6小鼠为正常对照组，3d后检测CD4+CD45.1+的增殖比例，e450的分裂峰并进行细胞绝对计数。9. CX3CR1GFP/GFP小鼠尾静脉回输CD45.1与OT II杂交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T细胞（标记e450），次日尾静脉回输细胞相关抗原，同时设正常C57BL/6小鼠为正常对照组，3d后检测CD4+CD45.1+的增殖比例， e450的分裂峰并进行细胞绝对计数。10. C57BL/6小鼠连续2d腹腔注射exosome抑制剂GW4869（1.25mg/kg/天），第3d同时尾静脉回输CD45.1与OT II杂交小鼠的CD4+Vβ5+Vα2+T细胞，第4d同时尾静脉回输细胞相关抗原，之后再连续2d腹腔注射GW4869，第7d检测CD4+CD45.1+的增殖比例， e450的分裂峰并进行细胞绝对计数。设立腹腔注射GW4869溶解剂DMSO(50ul/只/天）小鼠为对照组。结果1.小鼠脾脏内多种吞噬细胞具有吞噬细胞相关抗原的能力，其中包括巨噬细胞（吞噬细胞相关抗原总量的16%）、LDC（吞噬细胞相关抗原总量的19%）mDC（吞噬细胞相关抗原总量的1.5%）和pDC（吞噬细胞相关抗原总量的3.2%）等专职抗原提呈细胞以及小吞噬细胞如中性粒细胞（吞噬细胞相关抗原总量的18.6%）。2.静脉注射脂质体1d后，与正常对照组相比，注射CL组中脾脏mDC的清除率为50%，LDC清除率为99%，cDC清除率为50%，F4/80+MΦ清除率为100%，同时通过免疫荧光染色观察CD169和Marco两群巨噬细胞基本全部清除；注射CL5d后，mDC、LDC及cDC基本完全恢复；而F4/80MΦ清除率仍为100%，CD169和Marco两群巨噬细胞也基本全部清除；注射CL12d后，F4/80MΦ恢复到正常水平的67%，CD169和Marco两群巨噬细胞大部分恢复。3.注射CL1d、5d、12d后，与正常对照组相比，CD4+CD45.1+T细胞增殖的比例分别下降80%、60%、20%。4..与正常对照组相比，Batf3-/-转基因小鼠中CD4+CD45.1+T细胞增殖的比例下降70%。5.巨噬细胞与T细胞共培养3d后， T细胞增殖微弱（e-450分裂峰阳性率为3.39%）；巨噬细胞与T细胞共培养后，T细胞增殖的e-450分裂峰阳性率为22.6%；DC、巨噬细胞共同与T细胞共培养时，T细胞增殖的e-450分裂峰阳性率为38.1%。结果显示：脾脏巨噬细胞与DC各自与T细胞培养时，其T细胞的增殖均低于这两群细胞共同与T细胞培养组。6.回输细胞相关抗原（标记e450）1h后的脾脏巨噬细胞与Naive小鼠的脾脏DC共孵育1h、3h、4h、5h后，巨噬细胞向DC传递抗原的百分比分别为0.12%，0.7%，1.07%和1.55%。结果显示，随着时间延长，F4/80+巨噬细胞向DC传递抗原的数量亦在增加。7.回输细胞相关抗原（标记e450）1h后的脾脏巨噬细胞，Naive小鼠的脾脏DC以及DC、巨噬细胞共同与T细胞共培养后，T细胞增殖的e-450分裂峰阳性率分别为33.5%，2.97%，55.6%；结果显示，DC、巨噬细胞共同与T细胞共培养后，抗原特异的CD4+T细胞增殖能力明显上调8.小鼠腹腔注射PTx阻止细胞迁移后，CD4+CD45.1+T细胞增殖的比例与正常对照组相比下降70%。CX3CR1GFP/GFP小鼠中，CD4+CD45.1+T细胞增殖的比例与正常对照组相比下降20%。9.与正常对照组相比，小鼠腹腔注射GW4869后的CD4+CD45.1+T细胞增殖比例下降了20%。结论小鼠脾脏巨噬细胞可通过细胞迁移，释放包含抗原的exosome等方式向DC传递抗原，从而参与特异抗原诱导的CD4+T细胞免疫反应，为阐明体内专职抗原提呈细胞参与和调节特异性免疫应答的机理提供了一定的理论基础。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

浏览量

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