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作者

尚红记

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

刘运林

学位年度

2014

学位授予单位

泰山医学院

关键词

放射性脑损伤 Notch信号通路 碱性成纤维细胞生长因子 神经干细胞 DAPT

分类号

R739.91

摘要

放射性脑损伤(radiation injuries,brain,RIB)及其随之而来的放射性脑病是由于利用射线治疗头颈部的肿瘤后，造成的临近脑组织的直接或者间接损害及其损害所产生的相应并发症。患者罹患头部或者颈部的肿瘤后，至本病的中后期往往需要进行放射治疗，经过一定的潜伏期后大多数患者会产生神经系统的损伤，这种损伤一旦形成后损害往往很难逆转，严重影响着患者的健康与生存质量。 RIB发病机制目前尚无定论，目前的研究大部分集中到血管、细胞及免疫反应等诸多方面，例如血管结构的破坏，细胞组分的变性与坏死以及自身免疫物质的产生等。目前对放射性脑病的治疗方法较多，临床上以脱水降颅压、营养脑神经等治疗，虽然药物众多，但治疗效果往往一般且多缺乏明显的对因治疗。近年来，细胞因子、基因等新兴方法的出现为RIB的治疗提供了及其广泛的前景。Notch是一种细胞受体蛋白，它几乎存在于大多数的细胞中，特别是增殖能力较强的细胞中，它在信号传递过程中扮演着重要的角色，相邻细胞之间通过Notch信号通路的调控，影响着动植物的生长与发育，Notch信号通路及其保守。无论是在高等生物中还是在低等的生物中Notch信号通路都...更多

放射性脑损伤(radiation injuries,brain,RIB)及其随之而来的放射性脑病是由于利用射线治疗头颈部的肿瘤后，造成的临近脑组织的直接或者间接损害及其损害所产生的相应并发症。患者罹患头部或者颈部的肿瘤后，至本病的中后期往往需要进行放射治疗，经过一定的潜伏期后大多数患者会产生神经系统的损伤，这种损伤一旦形成后损害往往很难逆转，严重影响着患者的健康与生存质量。 RIB发病机制目前尚无定论，目前的研究大部分集中到血管、细胞及免疫反应等诸多方面，例如血管结构的破坏，细胞组分的变性与坏死以及自身免疫物质的产生等。目前对放射性脑病的治疗方法较多，临床上以脱水降颅压、营养脑神经等治疗，虽然药物众多，但治疗效果往往一般且多缺乏明显的对因治疗。近年来，细胞因子、基因等新兴方法的出现为RIB的治疗提供了及其广泛的前景。Notch是一种细胞受体蛋白，它几乎存在于大多数的细胞中，特别是增殖能力较强的细胞中，它在信号传递过程中扮演着重要的角色，相邻细胞之间通过Notch信号通路的调控，影响着动植物的生长与发育，Notch信号通路及其保守。无论是在高等生物中还是在低等的生物中Notch信号通路都发挥着重要的作用，细胞的增生与分化，神经系统的发育完全及器官等形成都离不开Notch信号通路。多项实验研究表明中枢神经系统存在Notch-Hes信号传递系统,这种系统可以抑制神经干细胞向神经细胞及胶质细胞的转化,维持神经干细胞的生长与增殖。γ-分泌酶是生物体内一种及其重要的酶类，它在Notch信号通路中处于显著的地位，随着人工合成技术的不断提高，人们发现了一种重要的化合物—DAPT，它是一种抑制物，能够明显的抑制γ-分泌酶，有效地减弱这种酶的活性，特异的阻断Notch通路的表达。DAPT的研究多集中在中枢神经系统的疾病，已有很多研究证实DAPT能够抑制体外细胞的增殖，且存在着明显的剂量依赖性。HES1基因是Notch受体蛋白下游的基因之一,已有研究表明利用DAPT处理HeLa细胞后,可以检测到HeLa细胞中Notch1的mRNA表达含量减少，由于Notch1表达的减少，其下游目标基因HES1的表达也会相应的减少。bFGF是一种具体作用机制尚不太明确的神经生长因子，它在新生血管的形成、创伤组织的修复与愈合过程中都有举足轻重的意义，在神经系统方面，其作用主要是促进对神经元和神经胶质细胞的增殖活性，在周围神经方面促进损伤组织的再生。目前关于bFGF的信号转导途径的作用机制已研究得比较清楚，主要包含：Ras/Raf/MEK/ERK、PKC、PI3K、JAK/STAT等重要途径。为更好地明确外源性bFGF治疗RIB的作用机制，了解Notch信号通路与bFGF抗辐射作用之间的关系，以C17.2神经干细胞(C17.2NSCs)为工具细胞，建立放射性神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)放射性损伤模型后，采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)分别与Notch信号通路的阻断剂DAPT处理接受放射损伤后C17.2NSCs及射线处理后的细胞，观察细胞的生长与增殖，检测Notch信号通路下游基因即Notch1,RBP-κ，Hes1，Hash1基因的表达，探讨Notch信号通路与外源性碱性成纤维细胞生长因子之间相互作用的可能机制。不但有助于阐明继发性放射性神经系统损伤的复杂病理过程，且有希望为放射性神经系统损伤寻找出新的治疗靶点，从而为设计出新型的阻断剂或特定部位的靶点信号分子的激活剂，等治疗药物等，为人类造福。目的1.建立C17.2NSC放射性损伤模型后观察不同时期Notch1, RBP-κ，Hes1，Hash1表达情况的差异。2.在bFGF参与对C17.2NSC保护的情况下，观察不同时期上述节点分子的表达情况，并做对比分析。3.加入γ-分泌酶抑制剂DAPT观察C17.2NSC放射性模型细胞不同时期的凋亡、坏死及增殖分化情况。研究方法1. C17.2神经干细胞常规培养2. C17.2神经干细胞Nestin免疫细胞化学染色3. MTT法检测细胞活性4.放射诱导C17.2神经干细胞凋亡及bFGF的保护作用和DAPT等的影响各种蛋白表达检测：⑴细胞免疫化学荧光染色⑵提取细胞总蛋白并检测含量1.细胞总蛋白的提取2.酶标仪检测蛋白含量3. Western Blot检测结果1.正常细胞培养：细胞接种后于第二日上午于显微镜下观察，细胞贴壁生长，大部分细胞呈三角形，不规则形，或圆形，多边形，细胞有较长的突起，相邻细胞之间突起可以相连，细胞培养约2-3天后，细胞贴满细胞培养瓶。2.对细胞进行免疫组化染色，神经干细胞中nestin蛋白抗原与抗体结合，结果显示经过细胞免疫组化染色后98%以上的细胞细胞质被染成棕色，苏木素复染后细胞核呈蓝色，细胞质棕色。细胞继续培养7-8代后，免疫组化染色阳性率仍在90%以上。3.从MTT OD结果表明，加入DAPT，神经干细胞的生长受限，且其浓度的越高，MTT OD值则越低，也即随着DAPT浓度的升高，细胞的生长抑制程度增加，加入碱性成纤维细胞生长因子后，与单纯DAPT组各组间两两比较，差异均有统计学意义(p <0.05)，即DAPT抑制细胞的生长，而碱性成纤维细胞能够减轻这种抑制作用，且存在着明显的剂量依赖性。4.经射线照射后MTT结果显示与正常对照组(未经射线照射)相比差异有统计学意义(p <0.05)，即射线能够损伤神经干细胞，抑制神经干细胞的生长；细胞在96孔板中贴壁生长后，加入不同设计浓度的DAPT后继续培养，一段时间后利用射线照射，MTT结果表明各组与空白对照组相比差异均有统计学意义(p <0.05)，加入不同浓度DAPT并经过射线处理后的各组与仅经过射线处理后组相比，差异均有统计学意义(p<0.05)。DAPT能够协同射线共同作用与神经干细胞，进一步抑制神经干细胞的生长，且随着DAPT浓度的升高，抑制作用愈强。成纤维细胞生长因子+DAPT+射线组与相同浓度的DAPT+射线处理组相比，各组之间均有统计学差异(p <0.05)，前组的MTT结果的OD值明显高于后者，即碱性成纤维细胞生长因子能够对抗DAPT及射线对神经干细胞的损伤作用，促进细胞的生长与增值，对神经干细胞有保护作用。5.利用流式细胞仪检测神经干细胞的生长于增殖，结果显示，与未经任何处理的组相比，照射组细胞的凋亡率及细胞死亡率均明显高于正常对照组。各组细胞贴壁生长后加入不同浓度的DAPT，细胞继续培养24h后再利用射线进行处理，流式细胞仪检测结果显示，随着DAPT浓度的升高，细胞的凋亡率及死亡率明显增加，各组间两两比较，差异有统计学意义(p <0.05)。不同DAPT组与单纯照射组相比，差异亦有统计学意义(p <0.05)。成纤维细胞生长因子+DAPT+射线组与相同浓度的DAPT+射线处理组相比，各组之间均有统计学差异(p <0.05)，前组的细胞凋亡率及细胞死亡率明显低于后者。6.细胞经过免疫荧光染色后结果显示，神经干细胞中存在Hes1及RBP-κ蛋白。细胞胞质在电子显微镜现观察呈现亮绿色。7. Western结果显示照射处理后的神经干细胞随bFGF浓度的升高RBP-κ蛋白的表达逐渐降低，而Hes1蛋白含量则逐渐升高；照射处理后的神经干细胞随DAPT浓度的升高RBP-κ蛋白的表达逐渐升高，而Hes1蛋白含量则逐渐降低；成纤维细胞生长因子+DAPT+射线组与相同浓度的DAPT+射线处理组相比，RBP-κ蛋白的表达降低，而Hes1蛋白含量则逐渐升高。结论1. DAPT能够抑制C17.2神经干细胞的生长，且其浓度的升高，抑制作用也越强；2.照射后的细胞，细胞的生长和繁殖受到明显的抑制，射线能够抑制神经干细胞的生长与增殖；3. DAPT与射线共同作用与神经干细胞，抑制神经干细胞的生长与增殖状态；4.碱性成纤维生长因子能够抑制DAPT及射线对神经干细胞的损伤，这种保护作用可能是通过Notch信号通路的作用，影响信号通路下游蛋白的表达而实现的。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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