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作者

孙臻

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

谭兰

学位年度

2014

学位授予单位

泰山医学院

关键词

癫痫持续状态 miRNA 凋亡

分类号

R742.1

摘要

目的癫痫是中枢神经系统常见病，目前影响着全球0.5%~1%的人群。选择性神经元死亡和苔藓纤维芽生等病理生理过程与癫痫的发生及发展有关。microRNA(miRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码小RNA，它通过诱导沉默复合体形成来降解靶mRNA，或者阻遏靶mRNA的翻译。最近越来越多的文献报道，miRNA在中枢神经系统疾病的发生发展中发挥着极为重要的作用。本实验通过建立杏仁核点燃癫痫持续状态模型的动物实验来探讨海马miRNA表达谱的变化，并且对癫痫持续状态后差异表达的miRNA与海马神经元凋亡的关系进行了评估。研究方法1、首先选用6~8周龄健康雄性SD大鼠，建立杏仁核点燃大鼠癫痫持续状态模型，于造模成功后24小时提取大鼠脑组织海马区miRNA，采用高通量测序技术研究癫痫持续状态后大鼠海马区脑组织与正常大鼠海马区脑组织中miRNA表达谱的差异。2、随后将筛选出的差异表达明显的6个miRNA用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)进行验证...更多

目的癫痫是中枢神经系统常见病，目前影响着全球0.5%~1%的人群。选择性神经元死亡和苔藓纤维芽生等病理生理过程与癫痫的发生及发展有关。microRNA(miRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码小RNA，它通过诱导沉默复合体形成来降解靶mRNA，或者阻遏靶mRNA的翻译。最近越来越多的文献报道，miRNA在中枢神经系统疾病的发生发展中发挥着极为重要的作用。本实验通过建立杏仁核点燃癫痫持续状态模型的动物实验来探讨海马miRNA表达谱的变化，并且对癫痫持续状态后差异表达的miRNA与海马神经元凋亡的关系进行了评估。研究方法1、首先选用6~8周龄健康雄性SD大鼠，建立杏仁核点燃大鼠癫痫持续状态模型，于造模成功后24小时提取大鼠脑组织海马区miRNA，采用高通量测序技术研究癫痫持续状态后大鼠海马区脑组织与正常大鼠海马区脑组织中miRNA表达谱的差异。2、随后将筛选出的差异表达明显的6个miRNA用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)进行验证。3、应用靶基因预测软件（RNAhybrid和miRand）对以上6个miRNA的目的候选靶mRNA进行了预测，并使用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）进行通路分析。4、最后检测此6个miRNA在癫痫持续状态后不同时间点（4小时，24小时，1周和3周）的动态变化，与此同时应用Nissel染色和TUNEL（Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP end-labeling assay）染色检测癫痫持续状态后不同时间点海马神经元生存和凋亡情况，进一步评估筛选出的miRNA是否与癫痫持续状态后神经元凋亡有关。结果1、杏仁核点燃癫痫持续状态大鼠和对照组正常大鼠海马组织差异表达的miRNA：在癫痫持续状态后24小时检测出差异表达的miRNA共37个，其中上调的miRNA有34个，下调的有3个。进一步筛选出在癫痫持续状态后变化大于2倍的（P＜0.01且P≠0）6个miRNA (miR-874-3p, miR-20a-5p, miR-345-3p, miR-365-5p, miR-764-3p andmiR-99b-3p)，在以上6个筛选出的miRNA中，上调的miRNA表达差异最大的是miR-879-5p （4.177倍），差异最小的是miR-764-3p （2.078倍），下调大于2倍的是miR-99b-3p。2、采用qRT-PCR对结果进行验证：将筛选出的变化明显的6个miRNA进行qRT-PCR验证，miR-874-3p, miR-20a-5p, miR-345-3p, miR-365-5p, miR-764-3p的表达量与正常对照组相比明显增高，而miR-99b-3p的表达量明显下降，此与高通量测序结果一致。3、靶基因预测：利用RNAhybrid和miRand两个靶基因预测软件对筛选出的6个miRNA的靶mRNA进行预测，KEGG通路分析进一步显示此6个miRNA的靶基因在癫痫持续状态后凋亡通路中发挥十分重要的作用。4、miRNA的动态变化和Nissel染色及TUNEL染色的病理结果：以上miRNA在癫痫持续状态后1周表达量的变化最明显，Nissel染色及TUNEL染色结果显示在癫痫持续状态后海马区脑组织生存神经元减少，凋亡神经元增多，且在癫痫持续状态后1周时最明显，这与筛选出的miRNA的动态变化相一致。进一步分析miRNA和癫痫持续状态后凋亡的关系显示miR-365-5p和miR-99b-3p的差异表达水平与癫痫持续状态后神经元凋亡具有明显相关性。结论大鼠癫痫持续状态后，海马区脑组织中miRNA的表达量发生明显变化，并且差异表达的miRNA是癫痫持续状态后神经元凋亡重要的调节因子。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

浏览量

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