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作者

殷殷

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

于爱莲，王玉

学位年度

2014

学位授予单位

泰山医学院

关键词

共表达基因 细胞因子 真核表达载体

分类号

R3416

摘要

目的本课题以人白细胞介素-4（白介素-4，Interleukin-4, IL-4），粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)为模型细胞因子,建立并优化人源性细胞因子的组合，并在真核细胞中稳定性表达重组蛋白及其活性研究，这为多细胞因子在体外能够共同表达提供了实验素材和理论参考。构建人GM-CSF、IL-4基因各自独立和经IRES元件串联的重组真核表达质粒pGM-CSF、 pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，转染细胞并经过连接免疫荧光（indirectimmunofluorescence assay， IFA）及酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）检测其表达活性，为构建永久表达细胞系做准备，同时人源细胞因子的体外表达及其诱生DC/CIK培养试剂盒的研发奠定了基础。方法1.引物和质粒的设计与合成依据GenBank上已经公布了的人源性GM-CSF、IL-4基因的参考序列。分别设计了附加酶切位点的引物，酶切位点为Xho I...更多

目的本课题以人白细胞介素-4（白介素-4，Interleukin-4, IL-4），粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)为模型细胞因子,建立并优化人源性细胞因子的组合，并在真核细胞中稳定性表达重组蛋白及其活性研究，这为多细胞因子在体外能够共同表达提供了实验素材和理论参考。构建人GM-CSF、IL-4基因各自独立和经IRES元件串联的重组真核表达质粒pGM-CSF、 pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，转染细胞并经过连接免疫荧光（indirectimmunofluorescence assay， IFA）及酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）检测其表达活性，为构建永久表达细胞系做准备，同时人源细胞因子的体外表达及其诱生DC/CIK培养试剂盒的研发奠定了基础。方法1.引物和质粒的设计与合成依据GenBank上已经公布了的人源性GM-CSF、IL-4基因的参考序列。分别设计了附加酶切位点的引物，酶切位点为Xho I、Bgl II和Sal I、Mlu I，以及质粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4。2.重组质粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4的构建经PCR扩增重组质粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4中的目的片段GM-CSF、IL-4；利用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行回收、琼脂糖凝胶回收纯化好的的PCR产物，分别在各自的酶切位点处进行双酶切，目的是回收两条目的基因片段GM-CSF和IL-4；用T4连接酶分别与经同步酶切的载体片段psT-ΔSG上进行连接，经在固体培养皿上长出的优势抗性菌落的常规筛选，构建单独表达GM-CSF、IL-4基因的重组质粒pGM-CSF、pIL-4；将目的基因与连接片段IRES分步连接到PsT-ΔSG载体上，经在固体培养皿上长出的优势抗性菌落的常规筛选，构建pGM-CSF-IRES-IL-4真核表达载体。3.重组质粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在CHO细胞中的瞬时表达将重组质粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在阳性脂质体的介导下转染CHO细胞，24小时后检测GM-CSF、IL-4在CHO细胞中的表达。4.IFA及Elisa检测表达情况对转染的CHO细胞用IFA和Elisa检测人源GM-CSF、IL-4基因的蛋白质表达。结果1.真核表达质粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4的构建成功构建的三种真核表达质粒pGM-CSF、pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，分别在经菌落PCR，质粒的PCR，琼脂糖凝胶电泳双酶切等方法鉴定后构建成功。2. IFA实验及Elisa实验检测GM-CSF、IL-4表达结果经过IFA的实验结果显示出，在荧光显微镜的下阳性表达的细胞大约在60%以上左右。Elisa的实验结果显示，GM-CSF、IL-4两种基因在培养的CHO细胞当中能够成功的表达。结论1.成功将人源基因GM-CSF、IL-4亚克隆入psT-ΔSG，分别构建了融合基因真核表达质粒pGM-CSF、pIL-4以及pGM-CSF-IRES-IL-42.人源细胞因子GM-CSF、IL-4在真核细胞中表达并鉴定正确，为构建人源细胞因子体外永久性表达细胞系及体外激活DC/CIK奠定了基础。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

浏览量

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