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作者

陶如

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

郝岗平

学位年度

2014

学位授予单位

泰山医学院

关键词

白花丹参 Sm HDR1 丹参酮 6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因 甘露糖 转基因筛选标记

分类号

S567.53;Q943.2

摘要

丹参是一味重要的传统的中草药,被广泛应用于各种心血管疾病的治疗。白花丹参(Salvia miltiorrhiza bge.f.alba C.Y.WU et H.W.Li)是紫花丹参的变种,山东特产药材之一。作为一个新品种已被列入《山东省中药材标准》(2000年版)。白花丹参与丹参具有基本相同的化学成分,含有脂溶性成分丹参酮类和可溶性酚酸成分,可作为丹参代替品。白花丹参主要生长在山东省的泰山周边,由于丹参活性成分在其植物含量较低,生长周期较长,再加上近年来由于环境恶化和过度采挖,加速了白花丹参的减产,还有环境的污染和农药使用等原因对种植产地的影响,白花丹参的数量和质量不能满足临床应用的需要。借助于植物基因工程和组织细胞工程相结合的生物方法,可以为这些药用活性成分生产提供有效的途径。我们从构建的白花丹参两年生根的c DNA文库中分离到1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase(HDR)基因全长,并对其功能进行了分析。HDR是植物MEP代谢途径的最后一个酶,命名为白花丹参HDR的Sm HDR1(Genbank Access...更多

丹参是一味重要的传统的中草药,被广泛应用于各种心血管疾病的治疗。白花丹参(Salvia miltiorrhiza bge.f.alba C.Y.WU et H.W.Li)是紫花丹参的变种,山东特产药材之一。作为一个新品种已被列入《山东省中药材标准》(2000年版)。白花丹参与丹参具有基本相同的化学成分,含有脂溶性成分丹参酮类和可溶性酚酸成分,可作为丹参代替品。白花丹参主要生长在山东省的泰山周边,由于丹参活性成分在其植物含量较低,生长周期较长,再加上近年来由于环境恶化和过度采挖,加速了白花丹参的减产,还有环境的污染和农药使用等原因对种植产地的影响,白花丹参的数量和质量不能满足临床应用的需要。借助于植物基因工程和组织细胞工程相结合的生物方法,可以为这些药用活性成分生产提供有效的途径。我们从构建的白花丹参两年生根的c DNA文库中分离到1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase(HDR)基因全长,并对其功能进行了分析。HDR是植物MEP代谢途径的最后一个酶,命名为白花丹参HDR的Sm HDR1(Genbank Accession Number JX516088),包含1,389-bp的ORF,编码463个氨基酸。推测的Sm HDR1蛋白,与其他植物物种的HDRs具有很高的同源性,N-端具有一个质体信号肽片段,同时还具有4个保守的Cys残基。转录模式分析表明Sm HDR1在叶片表达最高,在根部和茎部表达较低。在白花丹参毛状根里,0.1 m M methyl-jasmonate(Me JA)和salicylic acid(SA)可以明显诱导Sm HDR1表达量增高,但是对Abscisic acid(ABA)诱导不敏感。在大肠杆菌HDR突变体E.coli HDR mutant MG1655 ara<>isp H里表达Sm HDR1,结果发现Sm HDR1可以互补细菌HDR,具有HDR酶活性;在大肠杆菌TOP 10F’里同时表达胡萝卜素合成基因和Sm HDR1,结果发现Sm HDR1可以促进胡萝卜素的合成,说明Sm HDR1参与了细菌胡萝卜素生物合成途径,是一个有活性的功能蛋白。在白花丹参毛状根里过表达Sm HDR1,也表明Sm HDR1可以促进丹参丹参酮的生物合成。以上结果说明Sm HDR1是一个新的、很重要的参与白花丹参丹参酮生物合成的关键酶。本研究还首次构建了以PMI基因作为安全筛选标记的植物表达载体,并成功转化白花丹参,以期建立起具有生物安全性的白花丹参转基因体系,为白花丹参的遗传改良提供技术资料。首先从大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中克隆6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)基因,然后以PMI基因替换植物表达载体p CAMBIA1305中的hyg基因,构建了以PMI基因为选择标记基因的植物表达载体p CAMBIA1305-PMI,并用电击转化方法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中,用叶片浸染法转化白花丹参。在白花丹参MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1 mg/L固体分化培养基中附加20g/L甘露糖和10 g/L蔗糖为碳源的选择压力下,p CAMBIA1305-PMI的转化率为23.7%,对再生植株用PCR检测证实了PMI基因的导入。收起

学科

【教育部学科】农学

文献类型

学位论文

浏览量

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