改良菌落PCR法筛选、鉴定DHBV部分核衣壳蛋白基因的重组克隆

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摘要: 目的优化并验证改良菌落PCR程序的有效性。方法经常规PCR扩增DHBV编码核衣壳蛋白与DNA多聚酶重叠区的部分核苷酸片段(DHBc-dp),纯化特异性扩增产物并连入pMD 18-T载体,转化DH5α感受态细胞后涂布于Amp加倍的LB平板,记为亲代样品(PS),37℃培养12h,室温放置4h～8h。无菌操作挑取细菌转入优化的PCR反应液扩增、鉴定;余菌体室温放置完成二次生长。PS剩余PCR鉴定产物继代转化并涂布LB平板,记为继1代样品(F1S),同样进行菌落PCR鉴定。选取PS和F1S中PCR强阳性样品进行扩增及菌液PCR、质粒PCR、质粒酶切和测序鉴定。结果挑菌后的菌落二次生长成面积扩大的菌苔;优化菌落PCR反应体系保持、甚或提高了原有方法的高度特应性和稳定性;携外源目的片段的重组质粒在菌落PCR反应过程中能保持结构完整,并能在继代转化宿主细胞中忠实复制与扩增。结论改进的菌落PCR程序,继承了既有菌落PCR程序鉴定重组克隆的特异性和高效性,并能有效预防阳性转化子的丢失;同时,在增加优势抗性菌落生长量的前提下有效地抑制了卫星菌落的生长。

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