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作者

张华

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

胡成进

学位年度

2011

学位授予单位

泰山医学院

关键词

人组织激肽释放酶 hK6 原核表达 多克隆抗体 单克隆抗体

分类号

R73-3

摘要

目的人组织型激肽释放酶基因家族(Kallikreins,KLKs)是近年来新发现的肿瘤标志家族,属于丝氨酸蛋白酶家族,KLK6(Kallikrein6,KLK6)是该家族成员之一,编码人组织型激肽释放酶6(human Kallikrein6,hK6)。成熟的hK6蛋白含223个氨基酸,具有胰蛋白酶样活性,与乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、中枢神经系统疾病密切相关。其研究目的在于构建hK6原核表达载体并制备高效价、高特异度的多克隆抗体和单克隆抗体,为建立检测方法检测组织和体液中hK6奠定基础。方法1、提取人乳腺浸润导管癌组织中总RNA,反转录为cDNA,根据GeneBank发表的核苷酸序列D78203,设计KLK6引物,扩增出KLK6基因片段,先克隆入pMD-19T克隆载体SacⅠ、XhoⅠ位点,经菌落PCR、双酶切鉴定和基因测序后确定pMD-19T-KLK6的重组阳性菌,然后提取质粒,胶回收纯化KLK6目的片段,克隆入pET-28b原核表达载体的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21,筛选出阳性菌落后,IPTG诱导表达hK6融合蛋白,对诱导时间、温度进行优化并确定蛋白表达形式,扩大培养,大量表达...更多

目的人组织型激肽释放酶基因家族(Kallikreins,KLKs)是近年来新发现的肿瘤标志家族,属于丝氨酸蛋白酶家族,KLK6(Kallikrein6,KLK6)是该家族成员之一,编码人组织型激肽释放酶6(human Kallikrein6,hK6)。成熟的hK6蛋白含223个氨基酸,具有胰蛋白酶样活性,与乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、中枢神经系统疾病密切相关。其研究目的在于构建hK6原核表达载体并制备高效价、高特异度的多克隆抗体和单克隆抗体,为建立检测方法检测组织和体液中hK6奠定基础。方法1、提取人乳腺浸润导管癌组织中总RNA,反转录为cDNA,根据GeneBank发表的核苷酸序列D78203,设计KLK6引物,扩增出KLK6基因片段,先克隆入pMD-19T克隆载体SacⅠ、XhoⅠ位点,经菌落PCR、双酶切鉴定和基因测序后确定pMD-19T-KLK6的重组阳性菌,然后提取质粒,胶回收纯化KLK6目的片段,克隆入pET-28b原核表达载体的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21,筛选出阳性菌落后,IPTG诱导表达hK6融合蛋白,对诱导时间、温度进行优化并确定蛋白表达形式,扩大培养,大量表达蛋白,进行镍柱纯化、SDS-PAGE及western-blot检测。2、纯化hK6融合蛋白与弗氏佐剂等体积混合,乳化均匀后,免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,每10天加强免疫一次,四次免疫后抗体效价达峰值,对新西兰大白兔进行心脏采血,分离出血清,-80℃冰箱保存备用。BALB/c小鼠抗体效价达到10~5后,腹腔加强免疫一次,3天后取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,与预先培养并经8-AG筛选的骨髓瘤细胞SP2/0融合,HAT培养基选择培养,有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水获得单克隆抗体。间接ELISA方法检测抗体效价,纯化抗体后检测IgG亚型并进行western-blot检测和免疫组化检测,抗体纯化后保存于-80℃冰箱备用。结果1、成功构建pET-28b-KLK6原核表达载体,28℃、1mM IPTG诱导8小时时蛋白表达达峰值,且以可溶性形式表达,其hK6融合蛋白分子量为25KD。2、镍柱纯化的hK6融合蛋白免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,得到的抗血清效价为10~7;细胞融合后经有限稀释法筛选出4株分泌抗体的杂交瘤细胞株(DB2C4、DB3D7、BD3G7、DD3B5),回输小鼠腹腔,从腹水中提取单克隆抗体,效价均为51200;IgG亚型分析均为IgG1;western-blot表明,多抗和单抗都能与hK6融合蛋白特异性结合,免疫组织化学分析表明,hK6定位于细胞胞浆,在胃癌、乳腺癌、正常卵巢组织中均有表达。结论本课题成功构建了hK6的原核表达载体,通过诱导表达产物制备出高效价、高特异性的抗hK6的多克隆抗体与单克隆抗体,为深入研究hK6功能,及建立高特异性、高敏感性的检测方法,检测组织和体液中的hK6奠定基础。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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