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作者

孙伟

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

王增贤，文今福

学位年度

2010

学位授予单位

泰山医学院

关键词

轧 全细胞膜片钳技术 钾通道 皮层神经元 大鼠

分类号

Q42

摘要

目的体外原代培养新生大鼠大脑皮层神经元,观察其生长过程,并用全细胞膜片钳技术记录细胞外施加不同浓度的Gd3+后培养的神经元IA电流的变化,观察不同浓度Gd3+对IA电流变化的影响,分析Gd3+的神经毒性作用的相关信息,利用Gd3+作为离子探针,为后续研究离子通道结构与功能之间的关系等奠定实验基础。方法原代培养新生3d内Wistar大鼠皮层神经元,用全细胞膜片钳技术,记录培养的皮层神经元IA通道激活、失活电流在细胞外施加1、10、100、1000μmol/L Gd3+后的变化。1、新生大鼠大脑皮层神经元的原代培养及观察：新生Wistar大鼠,无菌条件取大脑皮层,用胰酶消化结合机械吹打方法分离细胞制成细胞悬液后在培养箱中培养,倒置相差显微镜下观察培养1、3、5、7、9 d等不同时间培养细胞的形态以及生长状态。2、神经元电流的全细胞膜片钳技术记录：于细胞培养的第7-10d选择生长状态良好的神经元进行记录。拉制电极、充灌电极液后电极阻抗约为4-6MQ,通过微操纵器移动微电极的位置使其与细胞膜形成细胞贴附式“高阻封接”后破膜,形成“全细胞记录”模式,记录钾通道激活电流和失活电流并用Boltzma...更多

目的体外原代培养新生大鼠大脑皮层神经元,观察其生长过程,并用全细胞膜片钳技术记录细胞外施加不同浓度的Gd3+后培养的神经元IA电流的变化,观察不同浓度Gd3+对IA电流变化的影响,分析Gd3+的神经毒性作用的相关信息,利用Gd3+作为离子探针,为后续研究离子通道结构与功能之间的关系等奠定实验基础。方法原代培养新生3d内Wistar大鼠皮层神经元,用全细胞膜片钳技术,记录培养的皮层神经元IA通道激活、失活电流在细胞外施加1、10、100、1000μmol/L Gd3+后的变化。1、新生大鼠大脑皮层神经元的原代培养及观察：新生Wistar大鼠,无菌条件取大脑皮层,用胰酶消化结合机械吹打方法分离细胞制成细胞悬液后在培养箱中培养,倒置相差显微镜下观察培养1、3、5、7、9 d等不同时间培养细胞的形态以及生长状态。2、神经元电流的全细胞膜片钳技术记录：于细胞培养的第7-10d选择生长状态良好的神经元进行记录。拉制电极、充灌电极液后电极阻抗约为4-6MQ,通过微操纵器移动微电极的位置使其与细胞膜形成细胞贴附式“高阻封接”后破膜,形成“全细胞记录”模式,记录钾通道激活电流和失活电流并用Boltzmann方程进行拟合。结果1、培养细胞的形态变化：分离的大鼠脑皮层细胞在接种后1h即出现附着贴壁现象,但此时细胞基本呈圆形；随着培养时间的延长,细胞形态逐渐出现椭圆形、梭形及不规则形,细胞突起逐渐增多变长。6-8h时可见1-2个细微的突起；3d时突起变长增多,初步形成稀疏的网状结构；5d时,突起数量明显增多,分支众多,相互交叉呈网状结构；培养至7-10d,突起形成密集网状结构。2、细胞外Gd3+对皮层神经元钾电流的影响：细胞外液中加入Gd3+时显著地抑制了IA电流幅值,并且随着Gd3+浓度的增加,电流的抑制程度也逐渐增大,1、10、100、1000μmol/L Gd3+的抑制率分别是(10.139±5.549)%、(21.24±7.011)%、(32.527±8.485)%和(45.199±10.104)%。3、细胞外不同浓度的Gd3+对IA稳态激活曲线的影响：1、10、100、1000μmol/L Gd3+作用前后IA的Vh值变化无统计学意义；1.10.100μmol/L Gd3+作用前后的k值变化无统计学意义,而1000μmol/L作用前后的k值增大,有统计学意义。4、细胞外不同浓度的Gd3+对IA稳态失活曲线的影响：1、10、100、1000μmol/L Gd3+作用前后1A的Vh值变化无统计学意义；1、10、100 umol/L Gd3+作用前后的k值变化无统计学意义；而1000μmol/L作用前后的k值增大,有统计学意义。结论1、原代培养的新生大鼠大脑皮层细胞在培养3-5d时生长速度最快,突起增多延长并相互交织成网状,培养至7-10d,细胞突起形成密集网状结构。2、细胞外液中加入Gd3+时显著地抑制了IA电流幅值,并且随着Gd3+浓度的增加,电流的抑制程度也逐渐增大,呈浓度依赖性。3、细胞外Gd3+离子浓度变化,对神经元IA电流稳态激活曲线没有显著作用。4、细胞外Gd3+离子浓度变化,对神经元IA电流稳态失活曲线没有显著作用。收起

文献类型

学位论文

浏览量

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