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作者

李美艺

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

牛敬忠

学位年度

2010

学位授予单位

泰山医学院

关键词

低氧预适应 脑脊液 脑匀浆提取液 血浆 腺苷 海马神经元 氧糖剥夺 SOD/MDA Bcl-2/Bax 脑损伤

分类号

R743

摘要

研究背景缺氧/缺血性脑损伤是神经系统常见病、多发病,不仅影响患者肢体运动功能和高级认知功能,而且具有较高致残率和死亡率,严重威胁人类健康和降低生活质量,给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。缺氧/缺血性脑损伤的脑保护治疗尤为重要,与患者预后密切相关。由于目前缺氧/缺血性脑损伤的脑保护治疗方法或措施疗效有限,所以脑保护治疗是国内外研究的热点、难点问题。预适应理论已经证实具有脑保护作用,相应机制已初步明确。缺氧/低氧/缺血预适应(Hypoxic/Ischemic Preconditioning, HPC/IPC)和药理性预适应(Pharmacological Preconditioning, PPC)都属于预适应理论范畴,如何达到预适应理论临床应用即增加其临床可操作性是转化医学亟待解决的问题。基于低氧预适应理论发明专利(名称：心脑血管保健治疗仪,发明人：吉训明等,专利号：200710176701)的问世为预适应理论抗缺氧/缺血性脑损伤即转化医学研究带来了动力和曙光。在预适应理论抗缺氧/缺血性脑损伤效应方面,我们既往研究发现,整体低氧预适应对小鼠急性脑梗死致脑缺血性损伤具有保护作用,仍存在预...更多

研究背景缺氧/缺血性脑损伤是神经系统常见病、多发病,不仅影响患者肢体运动功能和高级认知功能,而且具有较高致残率和死亡率,严重威胁人类健康和降低生活质量,给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。缺氧/缺血性脑损伤的脑保护治疗尤为重要,与患者预后密切相关。由于目前缺氧/缺血性脑损伤的脑保护治疗方法或措施疗效有限,所以脑保护治疗是国内外研究的热点、难点问题。预适应理论已经证实具有脑保护作用,相应机制已初步明确。缺氧/低氧/缺血预适应(Hypoxic/Ischemic Preconditioning, HPC/IPC)和药理性预适应(Pharmacological Preconditioning, PPC)都属于预适应理论范畴,如何达到预适应理论临床应用即增加其临床可操作性是转化医学亟待解决的问题。基于低氧预适应理论发明专利(名称：心脑血管保健治疗仪,发明人：吉训明等,专利号：200710176701)的问世为预适应理论抗缺氧/缺血性脑损伤即转化医学研究带来了动力和曙光。在预适应理论抗缺氧/缺血性脑损伤效应方面,我们既往研究发现,整体低氧预适应对小鼠急性脑梗死致脑缺血性损伤具有保护作用,仍存在预适应理论临床应用困难；为进一步增加临床可操作性,我们初步证实低氧预适应小鼠脑匀浆液提取液对大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧后神经细胞具有保护作用。故在前期研究基础之上,本实验研究将继续探讨预适应理论抗缺氧损伤效应,包括以下两方面内容：(1)低氧预适应Wistar大鼠脑脊液、脑匀浆提取液和血浆对原代培养的Wistar大鼠乳鼠海马神经元氧糖剥夺损伤的作用及相关机制；(2)腺苷药理性预适应对原代培养的Wistar大鼠乳鼠海马神经元氧糖剥夺损伤的作用及相关机制。以期通过本研究,明确预适应理论抗缺氧脑损伤效应,并为其转化医学研究奠定理论基础。研究目的1、探讨低氧预适应Wistar大鼠脑脊液、脑匀浆提取液和血浆对原代培养的Wistar大鼠乳鼠海马神经元氧糖剥夺损伤的作用及相关机制。2、探讨腺苷药理性预适应对原代培养的Wistar大鼠乳鼠海马神经元氧糖剥夺损伤的作用及相关机制。研究方法1、实验选用200-250g成年健康Wistar大鼠,雌雄不拘,进行低氧预适应模型复制并分别提取脑脊液、脑组织和血液,制成无菌脑脊液、脑匀浆提取液和血浆；出生24h内的Wistar大鼠乳鼠,取其海马组织进行神经元原代培养,然后进行氧糖剥夺培养。2、将培养的神经细胞随机分为正常对照组(N组)、单纯氧糖剥夺组(OGD组)、正常脑脊液/脑匀浆提取液/血浆干预+氧糖剥夺组(CSF/BH/BP+OGD组)和低氧预适应脑脊液/脑匀浆提取液/血浆干预+氧糖剥夺组(HPC+OGD组),用含Na2S2O4(1 mmol/L)的无糖Earle’s液复制神经元氧糖剥夺损伤模型,通过比色法比较低氧预适应和正常脑脊液、脑匀浆和血浆中SOD和MDA含量；采用AnnexinV/PI双染及免疫荧光染色法检测细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达状况。3、将原代培养的Wistar大鼠乳鼠海马神经元随机分为正常对照组(N组)、单纯氧糖剥夺组(OGD组)、低浓度腺苷预适应+氧糖剥夺作用(ADL+OGD组)、中浓度腺苷预适应+氧糖剥夺作用(ADM+OGD组)和高浓度腺苷预适应+氧糖剥夺作用(ADH+OGD组),采用AnexinV/PI双染及免疫荧光染色法,观察低、中、高三种腺苷浓度预处理对神经元氧糖剥夺损伤后凋亡和凋亡相关蛋白表达的影响。研究结果1、与正常大鼠脑脊液相比,低氧预适应大鼠脑脊液SOD含量升高(P<0.01),MDA含量降低(P<0.05)；与正常大鼠脑匀浆提取液相比,低氧预适应大鼠脑匀浆提取液SOD含量明显升高(P<0.01),MDA含量降低(P<0.01)；与正常大鼠血浆相比,低氧预适应大鼠血浆SOD含量升高(P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.01)。2、激光共聚焦显微镜检测AnnexinV/PI双染结果显示：N组偶有细胞凋亡, OGD组出现大量凋亡神经元。正常大鼠脑脊液(P<0.01)和低氧预适应脑脊液(P<0.01)对神经元氧糖剥夺损伤均有保护作用,后者作用更强(P<0.01);正常大鼠脑匀浆提取液对损伤神经元有微弱保护作用(P<0.05)低氧预适应大鼠脑匀浆提取液对损伤神经元有显著保护作用(P<0.01)；正常大鼠血浆能保护神经抗氧糖剥夺损伤(P<0.01),低氧预适应大鼠血浆能更大程度上减少损伤性神经元凋亡(P<0.01)。流式细胞仪检测与以上结果一致。3、Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达检测发现：N组仅有极少量Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达,OGD组有极少量Bcl-2蛋白表达和大量Bax蛋白表达。正常大鼠脑脊液和低氧预适应脑脊液均能显著增加Bcl-2蛋白表达(P<0.01),减少Bax蛋白表达(P<0.01),升高Bcl-2/Bax比率；正常大鼠脑匀浆提取液能在一定程度上增加Bcl-2蛋白表达(P<0.05),显著减低Bax蛋白表达(P<0.01),与正常大鼠脑匀浆提取液相比,低氧预适应大鼠脑匀浆提取液能显著增加Bcl-2蛋白表达(P<0.01),进一步降低Bax蛋白表达(P<0.05)；正常大鼠血浆可增加Bcl-2蛋白表达(P<0.05),对Bax蛋白表达无影响(P=0.063),低氧预适应血浆不但能更大程度上增强Bcl-2蛋白表达(P<0.01),还能明显降低Bax蛋白表达(P<0.01)4、腺苷预适应海马神经检测发现：与单纯氧糖剥夺组相比,低剂量腺苷预处理不能产生神经元氧糖剥夺损伤保护作用；中剂量腺苷预处理能减少氧糖剥夺诱导的神经元凋亡数量,增加Bcl-2蛋白表达(P<0.01),减低Bax蛋白表达(P<0.01)；高剂量腺苷预适应具有更显著的细胞保护作用,能进一步提高Bcl-2/Bax比率。研究结论1、低氧预适应能诱导大鼠脑脊液、脑匀浆提取液和血浆SOD活性升高和MDA含量降低。2、低氧预适应大鼠脑脊液、脑匀浆提取液和血浆能不同程度对抗神经元氧糖剥夺损伤诱导的细胞凋亡,该作用可能是通过降低氧化应激水平,上调Bcl-2蛋白表达和减少Bax蛋白表达实现的。3、中、高剂量的腺苷预适应能诱导神经元缺氧糖耐受性的提高,通过升高Bc1-2/Bax比率减少神经元凋亡,起到抗缺氧脑损伤效应。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

浏览量

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