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作者

王晓哲

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

白波，张秋玲

学位年度

2009

学位授予单位

泰山医学院

关键词

局灶性脑缺血再灌注 白花丹参 神经血管单元 脑微循环 凋亡

分类号

R285.5

摘要

目的 观察白花丹参对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑微循环及脑细胞的影响，探讨它在脑缺血再灌注后对脑组织的保护作用及其可能的机制，为白花丹参用于缺血性脑血管病的治疗提供实验依据。 方法 1．动物模型制备：采用大脑中动脉栓塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。 2．实验动物分组：健康成年SPF级SD大鼠，雌雄不限，随机分为实验对照组（sham operation control，sham）、脑缺血再灌注组（ischemia/reperfusion，I/R）和脑缺血再灌注+白花丹参干预组（ischemia/reperfusion+Salvia miltiorrhiza bge． f．alba， I/R+Sal．）。 3．白花丹参提取物的制备：将白花丹参（Salvia miltiorrhiza bge．f．alba， Sal．）粉碎后，参照药典规定的常规方法制备白花丹参粗制剂。 4．给药方法：取I/R+Sal．组大鼠，参考紫花丹参的用药剂量，于脑缺血再灌注术后30min灌胃给药，每天1次，用至取材时间，在最后一次给药后30...更多

目的 观察白花丹参对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑微循环及脑细胞的影响，探讨它在脑缺血再灌注后对脑组织的保护作用及其可能的机制，为白花丹参用于缺血性脑血管病的治疗提供实验依据。 方法 1．动物模型制备：采用大脑中动脉栓塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。 2．实验动物分组：健康成年SPF级SD大鼠，雌雄不限，随机分为实验对照组（sham operation control，sham）、脑缺血再灌注组（ischemia/reperfusion，I/R）和脑缺血再灌注+白花丹参干预组（ischemia/reperfusion+Salvia miltiorrhiza bge． f．alba， I/R+Sal．）。 3．白花丹参提取物的制备：将白花丹参（Salvia miltiorrhiza bge．f．alba， Sal．）粉碎后，参照药典规定的常规方法制备白花丹参粗制剂。 4．给药方法：取I/R+Sal．组大鼠，参考紫花丹参的用药剂量，于脑缺血再灌注术后30min灌胃给药，每天1次，用至取材时间，在最后一次给药后30min取材。 5．超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的检测：制备脑匀浆，参照南京建成生物技术有限公司提供的方法进行反应，利用比色法在550nm处检测OD值，根据公式计算SOD的活性。 6．丙二醛（malondialdehyde，MDA）的检测：制备脑匀浆，参照南京建成生物技术有限公司提供的方法进行反应，利用比色法在532nm处检测OD值，根据公式计算MDA的含量。 7．微量Na+-K+-ATP酶（Na+-K+-ATPase）的检测：制备脑匀浆，按照试剂盒提供的操作步骤进行酶促反应，在636nm波长处测定各管OD值，根据 公式计算ATPase活力。 8．内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）蛋白的表达：石蜡切片，免疫组织化学染色，显微镜下观察eNOS的表达。 9．基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）蛋白的表达：石蜡切片，免疫组织化学染色，显微镜下观察MMP-9的表达。 10．内皮抑素（endostatin，ES）蛋白的表达：石蜡切片，荧光免疫组织化学染色，激光共聚焦显微镜下观察ES的表达。 11．脑血流量（cerebral blood flow， CBF）的检测：激光多普勒血流仪（laserflowmetry， LDF）检测各组术后3d大鼠海马CA1区CBF占术前基础CBF的百分比。 12．脑缺血再灌注后脑细胞线粒体跨膜电位（mitochondrial transmembrane potential，一般用△ψm表示）的测定：制备脑组织单细胞悬液，罗丹明123（thodanmine123，Rh123）染色，流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测细胞内荧光强度，分析△Ψm的变化。 13．半胱氨酸天冬酶-3（cysteine-aspirate protease-3，Caspase-3）蛋白的表达：石蜡切片，荧光免疫组织化学染色，激光共聚焦显微镜下观察Caspase-3的表达。 14．脑缺血再灌注后脑细胞凋亡发生率（the incidence of apoptosis）的测定：制备单细胞悬液，进行AnnexinV-FITC+PI双染，通过FCM检测细胞内荧光强度，分析脑组织凋亡发生率的变化。 结果 1．I/R组与sham组比较：脑缺血再灌注后脑组织SOD活力明显降低（P<0．01）； MDA含量明显升高（P<0．01）；脑组织微量Na+-K+-ATP酶的活性明显降低（P<0．01）；eNOS表达明显升高（P<0．01）； MMP-9表达明显上调（P<0．01）；ES表达明显增加（P<0．01）；手术后海马CA1区血流量占术前百分比明显下降（P<0．01）；脑细胞线粒体跨膜电位在再灌注3h时明显下降（P<0．01），再灌注12h、48h下降（P< 0．05）；Caspase-3蛋白表达明显升高（P<0．01），脑细胞凋亡率明显升高（P<0．01）。 2．I/R+Sal组与I/R组比较：脑组织SOD活力于脑缺血再灌注3h时上调（P<0．05），于再灌注12h、24h、48h时明显上调（P<0．01）；脑组织MDA 含量于再灌注12h和48h时下降（P<0．05），于再灌注24h时显著下降（P<0．01）；脑组织微量Na+-K+-ATP酶的活性于再灌注3h、12h和48h时明显上调（P<0．01），于再灌注24h时上调（P<0．05）：脑组织eNOS蛋白表达于再灌注3h时升高（P<0．05），于再灌注12h、24h和48h时明显升高（P<0．01）；脑组织MMP-9蛋白表达于再灌注3h、12h和48h时明显下降（P<0．01），再灌注24h时下降（P<0．05）；脑组织ES蛋白表达于再灌注12h、24h和48h时明显减少（P<0．01），再灌3h时表达减少（P<0．05）；手术后海马CA1区脑血流量占术前百分比明显升高（P<0．01）；脑细胞线粒体跨膜电位于再灌注12h升高（P< 0．05），于再灌注48h时显著升高（P<0．01）；脑组织Caspase-3蛋白表达于再灌注24h和48h时明显下调（P<0．01），于再灌12h时下调（P<0．05）；脑细胞凋亡率在再灌注12h、24h、48h明显降低（P<0．01）。 结论 1．脑缺血再灌注可造成损伤侧脑组织线粒体功能障碍，血脑屏障损伤，脑微循环受损，脑血流量下降，氧自由基增加，脑细胞凋亡加重，对脑组织造成损伤。 2．急性缺血性脑损伤发生后超早期给予白花丹参干预，可明显保护线粒体功能，降低神经细胞的凋亡，对神经元有明显的保护作用。并且白花丹参可明显改善缺血部位的微循环，促进血管新生，增加脑血流量，清除氧自由基等代谢废物，并能保护血脑屏障功能。 3．脑缺血再灌注后超早期给予白花丹参可以从神经元和微血管两个角度对血管神经单元的结构和功能起到切实的保护作用，从而促进神经功能恢复，降低脑中风的死亡率和致残率。 4．本实验研究白花丹参对脑缺血再灌注损伤病理生理学机制的影响，为白花丹参用于缺血性脑血管病的治疗提供了实验依据，对于白花丹的参药学开发利用具有重要意义。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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