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作者

万云云

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

王增贤

学位年度

2007

学位授予单位

泰山医学院

关键词

星形胶质细胞 胶质纤维酸性蛋白 SV40T pSV3neo 转染

分类号

Q42

摘要

目的：体外培养、纯化大鼠脑皮质星形胶质细胞，获得高纯度的星形胶质细胞培养物，观察其生长过程及其生物学特性，采用脂质体方法将含有目的基因SV40T的质粒 pSV3neo 转入纯化的星形胶质细胞内，为后续创建永生化星形胶质细胞株作准备，并为研究不同发育时期星形胶质细胞的生物学特性等奠定基础。 方法：胰酶消化结合机械吹打方法分离大鼠脑皮质细胞，差速粘附处理及恒温摇床振荡法获得纯化星形胶质细胞，经含SV40T基因的质粒pSV3neo脂质体转染法转入星形胶质细胞，SV40T 抗原免疫荧光染色后检测转染结果。 1.星形胶质细胞的纯化培养及形态学观察：取新生Wistar大鼠大脑皮质，用胰酶消化结合机械吹打方法制成初细胞悬液，差速贴壁法去除成纤维细胞，培养至细胞融合并分层生长时，以恒温摇床振荡方法去除神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞等继续培养，获得纯化星形胶质细胞，并用GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。倒置相差显微镜下观察培养不同时间的细胞密度、突起长度及分支情况等并进行体视学测量以了解细胞的生长状态。 2.质粒抽提及鉴定：质粒pSV3neo转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经...更多

目的：体外培养、纯化大鼠脑皮质星形胶质细胞，获得高纯度的星形胶质细胞培养物，观察其生长过程及其生物学特性，采用脂质体方法将含有目的基因SV40T的质粒 pSV3neo 转入纯化的星形胶质细胞内，为后续创建永生化星形胶质细胞株作准备，并为研究不同发育时期星形胶质细胞的生物学特性等奠定基础。 方法：胰酶消化结合机械吹打方法分离大鼠脑皮质细胞，差速粘附处理及恒温摇床振荡法获得纯化星形胶质细胞，经含SV40T基因的质粒pSV3neo脂质体转染法转入星形胶质细胞，SV40T 抗原免疫荧光染色后检测转染结果。 1.星形胶质细胞的纯化培养及形态学观察：取新生Wistar大鼠大脑皮质，用胰酶消化结合机械吹打方法制成初细胞悬液，差速贴壁法去除成纤维细胞，培养至细胞融合并分层生长时，以恒温摇床振荡方法去除神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞等继续培养，获得纯化星形胶质细胞，并用GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。倒置相差显微镜下观察培养不同时间的细胞密度、突起长度及分支情况等并进行体视学测量以了解细胞的生长状态。 2.质粒抽提及鉴定：质粒pSV3neo转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经37℃振荡培养扩增后，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，所提质粒进行酶切后电泳分析，采集图像与质粒说明书比对，鉴定正确后大量扩增，用于后续转染实验。 3.质粒转染：纯化后细胞生长 1～2 d，其融合度分别达80％、90％接种密度时，以 3.0、4.0、5.0、6.0 μl/50μl 四种脂质体浓度和0.4、0.8、1.2、1.6 μg/50μl 四种质粒浓度组合后，混合于培养物中进行转染，SV40T抗原免疫荧光染色标记后检测，以阳性标记细胞率最高的细胞接种密度、脂质体浓度和质粒浓度，作为最终转染条件，进行规模转染。 4.转染细胞的观察：倒置相差显微镜下，观察转染过程中及转染后细胞的形态及生物学特性改变，比较转染细胞与未转染细胞的差异；免疫荧光染色方法检测SV40T抗原及GFAP在转染后细胞中的表达情况。 结果： 1.培养细胞的生长规律：分离的大鼠脑皮质细胞在接种后1 h开始贴壁，6～8 h后大部分细胞已贴壁，呈椭圆形、梭形及不规则形，部分细胞已开始铺展，并长出突起。随着培养时间的延长，细胞数量增多、体积增大，突起延长且数目增加，3～5 d时增加最明显。培养 7～10 d 后，细胞已融合并可见分层生长，底层为星形胶质细胞，上层为神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞等其它细胞。 2.纯化鉴定：根据细胞分层生长的特性，经摇床振荡处理后，显微镜下可见贴壁细胞形态较一致，胞体轮廓清晰，一级胞突丰富，分支较多，相互交织成网状；纯化后的细胞经GFAP免疫细胞化学染色后，阳性细胞胞浆及突起均呈棕色，星形胶质细胞纯度达98％以上，可用于后续实验。 3.质粒鉴定：质粒转化感受态细胞，经扩增、抽提后，酶切电泳，可清晰见到 4条带，与 1Kb DNA Ladder 比对，分子量对应于4.6、3.1、1.4、0.64 kbp，证明所提质粒为所需质粒pSV3neo。 4.转染优化试验：经脂质体、质粒浓度及细胞接种密度的转染优化试验，可得细胞融合度约90％时，以 5.0 μl/50μl 脂质体，1.2μg/50μl 质粒转染后，经免疫荧光染色可见较多阳性细胞，从而确定为转染最佳条件。 5.转染细胞观察：铺板细胞达到一定融合度后，加入质粒与脂质体的混合物，作用约 5h 时，显微镜下观察可见细胞胞体和突起肿胀，细胞轮廓清晰，立体感增强；48h 后观察可见部分细胞裂解死亡，存活细胞形态变化不大；经免疫荧光染色后，胞浆内呈现GFAP红色荧光，清晰显现出细胞轮廓，并可见SV40T绿色荧光。 结论： 1.原代培养的大鼠脑皮质细胞在培养3～5 d时增殖最明显，细胞数目增加，体积增大，突起增多延长并相互交织成网状；约7～10 d细胞融合并分层生长时进行恒温摇床振荡传代处理，所得星形胶质细胞纯度可达98％以上。 2.通过转染优化试验，可以确定转染的最佳条件为：24 孔板细胞融合度约90％，脂质体 5.0μl/50μl 和质粒1.2μg/50μl。优化条件确定后，转染实验可以根据培养板表面积增加的比例线性放大，扩大转染量，并用于后续永生化细胞株的筛选。 3.含目的基因SV40T的质粒pSV3neo转染纯化的星形胶质细胞后，免疫荧光染色检测到SV40T在星形胶质细胞内的表达产物SV40T抗原，转染成功。收起

文献类型

学位论文

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