获取途径

作者

程珂举

学位名称

硕士

导师姓名

翟静

学位年度

2016

学位授予单位

泰山医学院

关键词

前列腺癌 乙酰紫草素 ROS 氧化应激 DNA损伤 细胞凋亡

分类号

R737.25

摘要

目的本课题以雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC3及DU145作为研究对象,阐明ATM/ATR在乙酰紫草素诱导的氧化应激及DNA损伤中的作用及其信号调控通路,并探讨DNA损伤与乙酰紫草素诱导的前列腺癌细胞死亡之间的关系,为进一步研究提供依据。方法1.本实验以前列腺癌细胞PC3及DU145为研究对象,首先应用MTT法检测不同的浓度的乙酰紫草素作用于两种细胞,观察24h、48 h、72 h时细胞的增殖情况,确定乙酰紫草素的最佳作用时间和作用浓度;MTT法检测NAC清除ROS后PC3细胞的细胞活力。2.利用不同浓度的乙酰紫草素作用于DU145细胞及PC3细胞不同时间后用Mitosox、C11-BODIPY标记,37℃避光孵育15 min,通过流式细胞仪检测ROS的释放水平以及来源;不同浓度的乙酰紫草素作用于DU145细胞不同时间后DCFH-DA染色,37℃避光孵育15 min,借助流式细胞仪检测ROS。3.DNA end-joining实验检测不同浓度的乙酰紫草素作用于DU145细胞及PC3细胞24 h后对DNA损伤修复作用的影响。4.利用不同的浓度的乙酰紫草素处理DU145及PC3细胞24 h后...更多

目的本课题以雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC3及DU145作为研究对象,阐明ATM/ATR在乙酰紫草素诱导的氧化应激及DNA损伤中的作用及其信号调控通路,并探讨DNA损伤与乙酰紫草素诱导的前列腺癌细胞死亡之间的关系,为进一步研究提供依据。方法1.本实验以前列腺癌细胞PC3及DU145为研究对象,首先应用MTT法检测不同的浓度的乙酰紫草素作用于两种细胞,观察24h、48 h、72 h时细胞的增殖情况,确定乙酰紫草素的最佳作用时间和作用浓度;MTT法检测NAC清除ROS后PC3细胞的细胞活力。2.利用不同浓度的乙酰紫草素作用于DU145细胞及PC3细胞不同时间后用Mitosox、C11-BODIPY标记,37℃避光孵育15 min,通过流式细胞仪检测ROS的释放水平以及来源;不同浓度的乙酰紫草素作用于DU145细胞不同时间后DCFH-DA染色,37℃避光孵育15 min,借助流式细胞仪检测ROS。3.DNA end-joining实验检测不同浓度的乙酰紫草素作用于DU145细胞及PC3细胞24 h后对DNA损伤修复作用的影响。4.利用不同的浓度的乙酰紫草素处理DU145及PC3细胞24 h后,采用western-blot方法检测DNA损伤及凋亡相关蛋白的表达。加入ATM/ATR抑制剂、ROS清除剂NAC后各上述蛋白的表达变化。5.利用不同浓度的乙酰紫草素作用DU145细胞及PC3细胞不同时间,分别6 h、12 h、24 h后Annexin-V/PI双染常温避光孵育15 min,借助流式细胞仪分析细胞的凋亡率。6.不同浓度的乙酰紫草素作用DU145细胞24 h后,借助细胞核蛋白抽提试剂盒提取核蛋白,利用caspase3酶活性试剂盒检测caspase3的活性变化。结果1.乙酰紫草素作用24 h,PC3细胞的IC 50 =8.59±0.42μM;DU145细胞的IC 50 =7.5±0.38μM。加入10μM的ROS清除剂NAC后,PC3细胞的存活率与单加乙酰紫草素的处理组相比显著上升。2.用乙酰紫草素作用于PC3、DU145细胞6 h、12 h、24 h后,BODIPY染色,检测细胞ROS水平,未见明显变化。乙酰紫草素作用于细胞12 h、24 h后,DFCH-DA染色,检测细胞内ROS水平明显上升,且呈一定的剂量时间依赖。乙酰紫草素作用于细胞6 h、12 h、24 h后,Mitosox染色,检测细胞内ROS水平明显上升,且呈一定的剂量时间依赖,加NAC处理组ROS水平明显下降。3.不同浓度的乙酰紫草素对DU145细胞的DNA损伤修复起抑制作用,且呈一定的剂量时间依赖。4.不同浓度的乙酰紫草素作用于DU145/PC3细胞24 h后,γ-H2AX、PARP-1、p-Chk2蛋白表达含量明显上调,RAD51、Ku70/Ku80蛋白表达含量下调,加入活性氧清除剂NAC后,各蛋白表达量明显下调。加入ATM抑制剂后,γ-H2AX蛋白的表达水平下调。5.乙酰紫草素作用于PC3和DU145细胞6 h、12 h、24 h后,细胞的凋亡比例有明显的上升,DU145加入5 mM NAC、PC3加入10 mM NAC,可见凋亡比例下降明显。6.随着乙酰紫草素的浓度增加,caspase3的酶活性随之增加。结论乙酰紫草素可以抑制PC3细胞及DU145细胞的增殖,呈显著的剂量依赖性,同时乙酰紫草素可以诱导PC3及DU145细胞凋亡,其机制可能诱导线粒体超氧阴离子的产生、增强氧化应激介导的DNA损伤,抑制损伤修复有关。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

浏览量

43