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作者

门丽杰

学位名称

硕士

导师姓名

李光耀

学位年度

2016

学位授予单位

泰山医学院

关键词

慢性粒白血病 GPR137 细胞增殖 细胞凋亡

分类号

R733.72

摘要

研究背景慢性粒细胞白血病是常见血液肿瘤的之一,可在各年龄段发病,其特点是髓细胞的生产过剩导致其不受控制的生长和费城染色体阳性。尽管当今各种治疗手段不断发展,慢性粒细胞白血病的患者的症状得到极大的改善,但却不能根治本病,也不能阻滞其发展,因此寻找有效抑制白血病的靶标则至关重要。肿瘤的发生发展很是复杂和繁琐,涉及各种遗传学的变化。进入二十一世纪来,伴随分子生物学及遗传学的不停发展,肿瘤在基因方面的研究在想有一个全新的突破。采用小干扰片段、普通质粒载体和慢病毒载体等方法将相关研究的靶基因干扰片段载入目的细胞,上调或下调靶基因的表达,从而检测干扰后基因表达的变化及生物学行为的改变。G蛋白偶联受体家族是迄今为止最大的膜蛋白家族且参与信号传导,肿瘤细胞通过挟制GPCRs的正常生理功能,使恶性肿瘤细胞得以存活、增殖,进而逃掉免疫系统的监视,增加血管形成,侵袭周围组织或转移到其他器官 '' 。本研究通过慢病毒介导,靶向沉默慢性粒细胞白血病细胞株K562中的GPR137基因,初步探讨沉默G蛋白偶联受体137基因对慢性粒细胞白血病细胞株K562的增殖、克隆、周期及凋亡等生物学行为的影响,进而为慢性粒细胞白...更多

研究背景慢性粒细胞白血病是常见血液肿瘤的之一,可在各年龄段发病,其特点是髓细胞的生产过剩导致其不受控制的生长和费城染色体阳性。尽管当今各种治疗手段不断发展,慢性粒细胞白血病的患者的症状得到极大的改善,但却不能根治本病,也不能阻滞其发展,因此寻找有效抑制白血病的靶标则至关重要。肿瘤的发生发展很是复杂和繁琐,涉及各种遗传学的变化。进入二十一世纪来,伴随分子生物学及遗传学的不停发展,肿瘤在基因方面的研究在想有一个全新的突破。采用小干扰片段、普通质粒载体和慢病毒载体等方法将相关研究的靶基因干扰片段载入目的细胞,上调或下调靶基因的表达,从而检测干扰后基因表达的变化及生物学行为的改变。G蛋白偶联受体家族是迄今为止最大的膜蛋白家族且参与信号传导,肿瘤细胞通过挟制GPCRs的正常生理功能,使恶性肿瘤细胞得以存活、增殖,进而逃掉免疫系统的监视,增加血管形成,侵袭周围组织或转移到其他器官 '' 。本研究通过慢病毒介导,靶向沉默慢性粒细胞白血病细胞株K562中的GPR137基因,初步探讨沉默G蛋白偶联受体137基因对慢性粒细胞白血病细胞株K562的增殖、克隆、周期及凋亡等生物学行为的影响,进而为慢性粒细胞白血病的治疗提供新靶点和新思路。目的第一部分探讨慢病毒介导shRNA感染慢性粒细胞白血病细胞株K562是否成功沉默GPR137基因;第二部分主要探讨通过慢病毒介导shRNA感染K562细胞从而沉默GPR137基因以后对K562细胞的增殖、周期分布、克隆形成及凋亡等各种生物学特征的影响。方法1、构建Lv-shGPR137慢病毒载体,用人肾上皮细胞包装浓缩生成病毒液,感染慢性粒细胞白血病K562细胞。本实验将细胞分为三组:空白对照组,阴性对照组和GPR137基因沉默组。荧光显微镜观察慢病毒载体介导shRNA感染K562细胞的效果。2、采取实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法Western-blot检测慢病毒感染后GPR137基因的干扰效率。3、采取CCK-8法观察慢性粒白血病K562细胞体外生长情况;采取PI法使用流式细胞仪检测慢性粒白血病K562细胞周期的变化;采取克隆形成试验观察慢性粒细胞白血病K562细胞体外克隆形成情况。4、采取Annexin V-APC/7AAD法使用流式细胞仪检测慢性粒白血病K562细胞的凋亡情况。结果1、荧光显微镜下绿色荧光蛋白GFP显示,慢病毒Lv-shGPR137载体感染慢性粒细胞白血病K562细胞,其效率达90%左右。2、Real-timePCR检测GPR137基因沉默组慢性粒白血病细胞K562的GPR137mRNA的表达明显降低[%vs%、%,P<0.01]。Western blotting证实GPR137基因沉默组慢性粒细胞白血病细胞K562中GPR137蛋白含量明显下调。其中GPR137基因沉默组相对表达水平显著低于空白对照组及阴性对照组[%vs%、%,P<0.01],差异有统计学意义。3、CCK-8结果显示,与两个对照组比较,沉默GPR137基因后,K562生长受到明显抑制。感染120h后,GPR137基因沉默组K562细胞的增殖明显低于空白对照组和阴性对照组[%vs%,P<0.01]。克隆形成试验显示,GPR137基因沉默组细胞的集落形成能力明显低于空白对照组及阴性对照组[%vs%%,P<0.01]。流式细胞仪显示,其GPR137基因沉默组的细胞周期G0/G1期细胞比例较空白对照组及阴性对照组相比明显增加,提示沉默该基因使细胞周期阻滞于G0/G1期。4、流式细胞仪显示其GPR137基因沉默组凋亡率比空白对照组及阴性对照组明显增加,[%vs%、%,P<0.01]提示沉默GPR137基因可促进细胞的凋亡。结论1、慢病毒介导shRNA感染慢性粒白血病细胞K562后成功沉默GPR137基因2、GPR137基因的沉默可抑制慢性粒白血病细胞K562的增殖,阻滞细胞周期于G1期,抑制细胞的集落形成。3、GPR137基因的沉默可促进慢性粒白血病细胞K562的凋亡。4、GPR137基因或许可以作为慢性粒白血病诊断的一个新的肿瘤标志物,不久的将来或许可以作为慢性粒细胞白血病治疗的新靶点。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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