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作者

王慧云

学位名称

硕士

导师姓名

张继国，于杨

学位年度

2020

学位授予单位

山东第一医科大学

关键词

动脉粥样硬化斑块 2,3-吲哚醌 巨噬细胞源性泡沫细胞 氧化低密度脂蛋白 MAPK信号通路

分类号

R543.5

摘要

动脉粥样硬化属于血管壁慢性炎症性疾病，以过多的胆固醇沉积在动脉内膜下为主要特征，是造成心血管疾病患者致死致残最主要病理学基础。循环中低密度脂蛋白颗粒进入内皮下，被修饰后刺激内皮细胞分泌趋化因子，诱导单核细胞粘附并进入内皮下吞噬含大量胆固醇的LDL后形成泡沫细胞，泡沫细胞分泌趋化因子、炎症介质和粘附分子，在加重血管壁炎症反应的同时，使斑块脂质核心增大并形成坏死核心，斑块脆性增加。泡沫细胞摄入胆固醇通过清道夫受体A类和B类，主要是分化簇36等完成，摄入的胆固醇能继续促进CD36等介导的胆固醇摄入。ATP结合盒转运蛋白A1、ATP结合盒转运体G1在胆固醇流出这一动脉保护过程中起重要作用。通过内源性或外源性干预因素，减轻血管壁炎症、减少AS斑块中泡沫细胞胆固醇的含量是当前治疗AS性心脑血管的主要手段。 2，3-吲哚醌属于吲哚类化合物，是广泛存在于人和动物体内的大脑、外周组织和生物体液的内源性活性物质。既往研究表明，ISA具有抗炎、降低血脂等作用，但对AS斑块稳定性的作用和分子机制不明。因此，我们用ISA干预巨噬细胞源性泡沫细胞，以脂质代谢和炎症反应为研究靶点，探讨ISA对AS过程中巨噬细胞泡沫...更多

动脉粥样硬化属于血管壁慢性炎症性疾病，以过多的胆固醇沉积在动脉内膜下为主要特征，是造成心血管疾病患者致死致残最主要病理学基础。循环中低密度脂蛋白颗粒进入内皮下，被修饰后刺激内皮细胞分泌趋化因子，诱导单核细胞粘附并进入内皮下吞噬含大量胆固醇的LDL后形成泡沫细胞，泡沫细胞分泌趋化因子、炎症介质和粘附分子，在加重血管壁炎症反应的同时，使斑块脂质核心增大并形成坏死核心，斑块脆性增加。泡沫细胞摄入胆固醇通过清道夫受体A类和B类，主要是分化簇36等完成，摄入的胆固醇能继续促进CD36等介导的胆固醇摄入。ATP结合盒转运蛋白A1、ATP结合盒转运体G1在胆固醇流出这一动脉保护过程中起重要作用。通过内源性或外源性干预因素，减轻血管壁炎症、减少AS斑块中泡沫细胞胆固醇的含量是当前治疗AS性心脑血管的主要手段。 2，3-吲哚醌属于吲哚类化合物，是广泛存在于人和动物体内的大脑、外周组织和生物体液的内源性活性物质。既往研究表明，ISA具有抗炎、降低血脂等作用，但对AS斑块稳定性的作用和分子机制不明。因此，我们用ISA干预巨噬细胞源性泡沫细胞，以脂质代谢和炎症反应为研究靶点，探讨ISA对AS过程中巨噬细胞泡沫化过程的作用，并探讨可能的分子机制。 目的： 观察不同剂量ISA对泡沫细胞胆固醇蓄积和肿瘤坏死因子-α、白介素-1β的影响，以及MAPK/NF-κB信号通路表达的变化，为防治AS性心脑血管疾病提供基础实验依据。 方法： ①制备氧化低密度脂蛋白，采用超速离心法获取LDL，采用硫酸铜氧化法氧化修饰LDL。 ②用细胞计数试剂盒法检测不同浓度ISA对鼠源性巨噬细胞系RAW264.7细胞活性的影响，分组：空白对照组、二甲基亚砜溶剂对照组、低剂量ISA组、中剂量ISA组、高剂量ISA组；不同浓度ISA作用24h后，收集细胞检测细胞存活率。 ③选取合适ox-LDL浓度，ISA预处理1h，ox-LDL诱导24h后检测不同浓度ISA对泡沫细胞的增殖及抑制作用。 ④用选取ox-LDL的浓度处理RAW264.7巨噬细胞24h,吞噬脂质形成泡沫细胞。用不同浓度ISA预先处理1h,根据不同药物浓度分为对照组、模型组、低剂量的药物组、中剂量的药物组、高剂量的药物组共孵育24h。油红O染色观察ISA对泡沫细胞内脂滴的影响；酶法检测泡沫细胞内胆固醇的含量。 ⑤RT-qPCR方法检测TNF-α、IL-1βmRNA的表达。按照试剂盒说明，Trizol法提取RAW264.7总的RNA，测定RNA的含量和纯度，将RNA反转录为cDNA。使用SuperRealPreMixPlus试剂盒进行PCR扩增。检测各组中TNF-α、IL-1βmRNA的表达。 ⑥Westernblot检测RAW264.7胆固醇转运子表达。 ⑦进一步观察ISA对核因子-κB信号通路的p65亚单位、核因子-κB抑制蛋白、P-P65、P-IκB蛋白和c-Jun氨基末端激酶、细胞外调节蛋白激酶、P38蛋白等丝裂原活化蛋白激酶蛋白磷酸化水平。 结果： ①CCK-8结果显示ISA对RAW264.7来源泡沫细胞无毒性作用。ox-LDL组细胞活性下降，ISA剂量组与ox-LDL组比较，随着ISA浓度的增加，细胞活性呈现剂量依赖性增加。 ②体外培养的巨噬细胞，未经处理的巨噬细胞无油红O着色，与100mg/Lox-LDL共培养后，红色脂滴遍布，ISA处理过细胞红色脂滴数量呈现剂量依赖性降低。其平均IA值分别为ox-LDL组的65.44%、44.84%、36.37%。 ③模型组细胞内TC、FC、CE水平显著高于对照组，且CE/TC有显著性差异。与模型组比较，ISA中、高剂量组TC、CE水平及CE/TC水平均有显著性下降，ISA低剂量组除TC显著降低外，其它无明显变化。ISA高剂量组显著降低FC的水平。 ④模型组TNF-a、IL-1βmRNA表达增加，不同浓度ISA各组均能显著降低TNF-amRNA表达，且组间无显著性差异。随着ISA浓度的增加，ISA中、高剂量组较ox-LDL组的IL-1βmRNA表达显著下降。 ⑤研究ISA对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇摄入和流出的影响，并利用免疫印迹检测胆固醇摄入和流出关键蛋白的变化。模型组CD36、SR-A蛋白表达明显高于对照组，与模型组比较，ISA低、中剂量下调有趋势但无显著性差异，而ISA高剂量下调极明显。这些结果表达ISA减少胆固醇摄入通过下调CD36清道夫受体表达而实现的。在胆固醇流出方面，ISA可以上调ABCA、ABCG蛋白表达促进胆固醇的流出 ⑥ISA对MAPK信号通路和NF-κB通路的相关蛋白表达不同程度的升高和降低,与对照组相比，在ox-LDL诱导巨噬细胞源性泡沫细胞中磷酸化p38MAPK、JNK、ERK、P65和IκB均显著增加，与ox-LDL组比较，ISA干预组磷酸化p38MAPK、JNK、P65和IκB的表达量显著下降，但是ERK磷酸化水平无差异。 结论： ISA减少巨噬细胞源型泡沫细胞内脂质蓄积，与降低CD36、SR-A表达和增加ABCA1、ABCG1表达有关；ISA对巨噬细胞源性泡沫细胞TNF-α、IL-1β炎症因子表达。与MAPK和NF-κB激活下降有关。收起

文献类型

学位论文

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