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作者

段伟

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

宋文刚，唐华

学位年度

2014

学位授予单位

泰山医学院

关键词

动脉粥样硬化 CD103+DC CD8+DC Th1细胞

分类号

R543.5

摘要

目的：动脉粥样硬化是一种免疫相关的慢性炎症性疾病，天然免疫和适应性免疫在动脉粥样硬化中均发挥至关重要的作用。不同T细胞亚群在动脉粥样硬化发生发展过程中发挥重要作用，树突状细胞在动脉粥样硬化过程中参与调控T细胞反应。Baft3是调控树突状细胞亚群分化的关键性转录因子。本课题研究Baft3依赖的树突状细胞亚群对动脉粥样硬化疾病的影响。并深入探讨其对天然免疫和适应性免疫的调控作用，为将来动脉粥样硬化的预防及治疗提供理论依据。方法：1、通过小鼠杂交技术建立Batf3-/-小鼠与Apoe-/-小鼠双基因缺陷小鼠。主要方法为Batf3-/-小鼠与Apoe-/-小鼠杂交产生F1代，继续将F1代合笼杂交产生F2代，经几轮杂交后，通过对Batf3基因和Apoe基因进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定小鼠基因型。进一步通过流式细胞仪分析小鼠脾脏和主动脉DC亚群的变化。2、以Apoe-/-小鼠为对照，通过高脂饮食诱导Batf3-/-Apoe-/-双基因缺陷小鼠动脉粥样硬化疾病模型。3、Batf3-/-Apoe-/-双基因缺陷小鼠高脂饮食9周，进行心脏灌注，包埋心脏，进行冷冻切片。4、对切片进行油红O...更多

目的：动脉粥样硬化是一种免疫相关的慢性炎症性疾病，天然免疫和适应性免疫在动脉粥样硬化中均发挥至关重要的作用。不同T细胞亚群在动脉粥样硬化发生发展过程中发挥重要作用，树突状细胞在动脉粥样硬化过程中参与调控T细胞反应。Baft3是调控树突状细胞亚群分化的关键性转录因子。本课题研究Baft3依赖的树突状细胞亚群对动脉粥样硬化疾病的影响。并深入探讨其对天然免疫和适应性免疫的调控作用，为将来动脉粥样硬化的预防及治疗提供理论依据。方法：1、通过小鼠杂交技术建立Batf3-/-小鼠与Apoe-/-小鼠双基因缺陷小鼠。主要方法为Batf3-/-小鼠与Apoe-/-小鼠杂交产生F1代，继续将F1代合笼杂交产生F2代，经几轮杂交后，通过对Batf3基因和Apoe基因进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定小鼠基因型。进一步通过流式细胞仪分析小鼠脾脏和主动脉DC亚群的变化。2、以Apoe-/-小鼠为对照，通过高脂饮食诱导Batf3-/-Apoe-/-双基因缺陷小鼠动脉粥样硬化疾病模型。3、Batf3-/-Apoe-/-双基因缺陷小鼠高脂饮食9周，进行心脏灌注，包埋心脏，进行冷冻切片。4、对切片进行油红O染色检测主动脉根部斑块的形成，并通过软件计算主动脉根部斑块面积大小及官腔比。并采用HE染色观察主动脉斑块中炎症细胞的浸润。5、检测实验组和对照组体重的变化及用生化分析仪检测血浆中总胆固醇和甘油三脂浓度。6、取脾脏、主动脉用酶消化并制备单细胞悬液。采用多色荧光标记及流式细胞仪检测，并用Flowjo软件进行分析脾脏的DC亚群的变化及功能分子的表达，以及中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、T细胞、B细胞的比例，及活化增殖的影响。7、采用刺激液刺激并进行胞内细胞因子染色，检测Th1和Th17细胞的变化8、胞内细胞因子染色，检测调节性T细胞的变化。9、以C57小鼠为对照，Apoe-/-高脂饮食9周后，分选小鼠脾脏CD8+DC和CD8-DC亚群，通过Real-time PCR检测IL-12P35基因表达。结果：1、通过小鼠杂交及PCR鉴定筛选出Batf3基因和Apoe基因双缺陷的小鼠，命名为Batf3-/-Apoe-/-小鼠。通过流式细胞仪检测Batf3-/-Apoe-/-双缺陷小鼠发现脾脏CD8a+DC亚群显著减少（P <0.001）和主动脉CD103+DC亚群缺失2、高脂饮食9周后油红O染色表明，与对照组Apoe-/-小鼠相比，Batf3-/-Apoe-/-双基因缺陷小鼠主动脉根部斑块面积显著减小，HE染色结果表明斑块内炎性细胞浸润明显减少。3、通过生化分析仪检测发现，与对照组Apoe-/-小鼠相比，Batf3-/-Apoe-/-双基因缺陷小鼠血浆总胆固醇和甘油三脂均无显著差异。体重检测两组间也无显著差异。4、通过流式细胞仪检测发现，Batf3-/-Apoe-/-双基因缺陷小鼠脾脏CD8a+DC亚群显著减少（P <0.001）且主动脉CD103+DC亚群缺失。脾脏cDC比例显著升高，而其IA/IE的表达显著降低。5、通过流式细胞仪检测发现，与对照组Apoe-/-小鼠相比，Batf3-/-Apoe-/-双基因缺陷小鼠脾脏中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、CD8+T细胞、B细胞比例均无显著差异，而CD4+T细胞比例显著增加。6、对脾脏B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞活化、增殖的流式细胞仪检测结果表明，两组之间B细胞、CD8+T细胞活化、增殖均无显著差异。Batf3缺陷不影响CD4+T细胞的活化而其增殖显著增加。7、通过胞内细胞因子染色及流式细胞分析表明，与对照组Apoe-/-小鼠相比Batf3-/-Apoe-/-双基因缺陷小鼠Th17和Treg细胞均无显著差异，而Th1细胞比例显著减少（P <0.001）。8、通过Real-time PCR检测IL-12P35基因的表达发现，与C57小鼠相比，Apoe-/-小鼠CD8+DC表达的IL-12P35显著增加，而CD8-DC表达的IL-12P35无明显差异。结论：1、在动脉粥样硬化疾病发生过程中，Batf3缺陷引起主动脉根部斑块面积显著减小，斑块内炎性细胞浸润明显减少而不影响血浆中总胆固醇和甘油三酯的浓度。2、Batf3缺陷引起脾脏CD8a+DC亚群显著减少（P <0.001）且主动脉CD103+DC亚群缺失，Batf3依赖的DC亚群可能是通过高表达IL-12P35诱导Th1分化进而促进动脉粥样硬化斑块的形成。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

浏览量

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