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作者

张超

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

邵先玉

学位年度

2013

学位授予单位

泰山医学院

关键词

PTCH1 基因甲基化 食管癌 Eca109 5-Aza-dC

分类号

R735.1

摘要

目的研究PTCH1基因甲基化与食管癌发生发展的关系及其作用机制，同时探讨去甲基化试剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-dC）对食管癌的治疗作用。方法（1）应用亚硫酸氢钠测序法（bisulfite sequencingPCR BSP)技术检测食管癌细胞株Eca109、30例未经放疗和化疗的食管鳞癌病人的癌组织以及癌旁正常组织中PTCHl基因的甲基化情况，以发生甲基化的CpG位点个数占整个检测的CpG位点为甲基化程度的量化指标，使用配对t检验来进行PTCHl表达与其基因甲基化程度的相关性分析，以及PTCHl基因甲基化与食管癌发生发展的关系。（2）使用不同浓度的甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC对人食管癌细胞株Eca109进行药物干预，倒置显微镜下观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测细胞生长，磷酯酰丝氨酸结合蛋白（AnnexinV）/碘化丙啶（propidium iod PI）细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡，SYBR Green实时定量PCR检测不同浓度5-Aza-dC药物干预后Eca109细胞PTCHlmRNA相对表达量的变化，使用t检验进行各试验组以及对照组数据进行统计分析。结...更多

目的研究PTCH1基因甲基化与食管癌发生发展的关系及其作用机制，同时探讨去甲基化试剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-dC）对食管癌的治疗作用。方法（1）应用亚硫酸氢钠测序法（bisulfite sequencingPCR BSP)技术检测食管癌细胞株Eca109、30例未经放疗和化疗的食管鳞癌病人的癌组织以及癌旁正常组织中PTCHl基因的甲基化情况，以发生甲基化的CpG位点个数占整个检测的CpG位点为甲基化程度的量化指标，使用配对t检验来进行PTCHl表达与其基因甲基化程度的相关性分析，以及PTCHl基因甲基化与食管癌发生发展的关系。（2）使用不同浓度的甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dC对人食管癌细胞株Eca109进行药物干预，倒置显微镜下观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测细胞生长，磷酯酰丝氨酸结合蛋白（AnnexinV）/碘化丙啶（propidium iod PI）细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡，SYBR Green实时定量PCR检测不同浓度5-Aza-dC药物干预后Eca109细胞PTCHlmRNA相对表达量的变化，使用t检验进行各试验组以及对照组数据进行统计分析。结果（1）使用NBCI查找PCTH1转录体，发现共计7个转录体和转录蛋白，应用Methyl Primer Express software v1.0对PTCH11b mRNA转录体的-2580～5341bp进行CpG岛分析，发现六个CpG岛，根据需要设计扩增出-820～426bp的BSP引物，内含19个CpG岛。（2）30例病人的癌旁组织都没有发生完全甲基化，7例患者存在PTCH1基因甲基化的癌旁组织，未发现完全甲基化的癌旁组织；30例患者中28例患者食管癌组织PTCH1基因甲基化，其中食管癌组织PCTH1部分甲基化18例，食道癌组织PCTH1完全甲基化10例，经统计学比较，食管癌患者的食管癌组织与癌旁组织PTCH1基因甲基化率存在一定差异（P<0.05）。（3）食管癌细胞株Eca109DNA大部分发生甲基化，甲基化程度（99.7±0.72）%，食管癌组织的部分DNA发生甲基化，甲基化程度为18%~99%,平均甲基化程度为（64.6±5.72）%，癌旁组织的甲基化程度为0%~37%，平均甲基化程度为（16.6±2.72）%，经比较，癌旁组织与食管癌组织间的甲基化程度存在显著性差异（P<0.01）。（4）不同浓度5-Aza-dC药物干预Eca109细胞株后，测定490nm处的OD值，具体结果见表1，1um、2um、5um组与对照组比较OD值，均存在统计学差异（P<0.05）,10um与对照组OD值比较，无统计学差异（P>0.05）。（5）不同浓度干预后，不同5-Aza-dC组的细胞凋亡率与对照比较，1um、2um、5um组与对照组比较，细胞凋亡率均存在统计学差异（P<0.05），10um与对照组比较，细胞凋亡率无统计学差异（P>0.05）。结论（1）食管癌PTCHl基因启动子区CpG岛发生甲基化是食管癌组织区别于正常食管组织的分子事件，通过抑制PTCHl基因表达参与食管癌的发生发展。PTCHl基因甲基化水平可作为食管癌早期诊断和鉴别诊断的一个新的分子标志物。（2）食管癌细胞株Eca109中PTCHl基因甲基化可以用去甲基化试剂5-Aza-dC药物进行甲基化处理，且5-Aza-dC药物要在一定浓度范围内才其作用，可以用于食管癌的治疗和预后。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

浏览量

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