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作者

张谦

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

刘运林

学位年度

2012

学位授予单位

泰山医学院

关键词

丁苯酞 放射性脑损伤 大鼠 海马 MMP-9

分类号

R818

摘要

放射性脑损伤（radiation injuries of brain; RIB）是神经系统肿瘤和颈区肿瘤放射治疗后的严重并发症，由于其部位的限制，手术切除或化学治疗的效果往往不明显，放射治疗有效,且在某些肿瘤可能是唯一的治疗手段。尤其是随着近年来颅面颈区肿瘤发病率的不断增加，肿瘤病人生命时间的不断延长，病人接受放射治疗的次数逐渐增多，从而增加了放射性脑损伤的发病率。目前临床上对RIB的治疗以应用激素及脱水剂对症支持治疗为主，治疗效果欠佳，因此，寻找有效的治疗药物是十分必要的。我们在以往的研究过程中，建立了放射性脑损伤的大鼠动物模型，观察出放射性脑损伤后可引起大鼠的学习记忆能力下降。本课题采用RIB大鼠作为模型，通过对经过丁苯酞治疗过的RIB大鼠其行为学及海马病理学表现与未经治疗RIB大鼠做比较，为解释丁苯酞治疗RIB的机制提供指导。学习与记忆都是大脑较为复杂的高级智能活动，学习是经验和技能的模仿与获得，记忆则是经验和技能的总结与积累。学习与记忆是两个不同的神经生物过程，只有两者紧密联系、密切配合，才能使人体完成一系列复杂的大脑活动。记忆可分为瞬时记忆、短时记忆、长时记忆和永久记忆。已有...更多

放射性脑损伤（radiation injuries of brain; RIB）是神经系统肿瘤和颈区肿瘤放射治疗后的严重并发症，由于其部位的限制，手术切除或化学治疗的效果往往不明显，放射治疗有效,且在某些肿瘤可能是唯一的治疗手段。尤其是随着近年来颅面颈区肿瘤发病率的不断增加，肿瘤病人生命时间的不断延长，病人接受放射治疗的次数逐渐增多，从而增加了放射性脑损伤的发病率。目前临床上对RIB的治疗以应用激素及脱水剂对症支持治疗为主，治疗效果欠佳，因此，寻找有效的治疗药物是十分必要的。我们在以往的研究过程中，建立了放射性脑损伤的大鼠动物模型，观察出放射性脑损伤后可引起大鼠的学习记忆能力下降。本课题采用RIB大鼠作为模型，通过对经过丁苯酞治疗过的RIB大鼠其行为学及海马病理学表现与未经治疗RIB大鼠做比较，为解释丁苯酞治疗RIB的机制提供指导。学习与记忆都是大脑较为复杂的高级智能活动，学习是经验和技能的模仿与获得，记忆则是经验和技能的总结与积累。学习与记忆是两个不同的神经生物过程，只有两者紧密联系、密切配合，才能使人体完成一系列复杂的大脑活动。记忆可分为瞬时记忆、短时记忆、长时记忆和永久记忆。已有大量研究表明，海马结构广泛参与学习记忆能力，尤其短时记忆和近期记忆[1]，在研究中，人们发现CA3区与空间辨别性学习记忆活动的关系尤为密切[2]，从解剖学上来看，长时记忆与海马突触形态、功能以及突触联系的建立、突触的可塑性变化具有密切的联系。学习记忆与海马内胆碱能、单胺能系统、氨基酸能系统具有密切的联系。因此，我们在本次实验中选用大鼠的海马区域进行组织病理学研究。丁苯酞，其化学名称为消旋-3-正丁基苯酞（dl-3n-butylphthalide, NBP），它的有效成分与从芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素结构相同，中国医学科学院与中国协和医科大学药物研究所联合开发出其异构体右旋丁基苯酞并将它们合成人工消旋体，成为一类国家级新药[3]，该药物可明显缩小脑缺血区的卒中面积，抗脑血栓形成、抗血小板聚集，改善脑循环，促进脑代谢，减轻脑水肿，抑制神经细胞凋亡等。对该药的研究目前多因为其较好的改善脑缺血患者的预后，其机制可能主要通过减少脑组织和血管内花生四烯酸的含量，从而达到加快血管内皮细胞合成一氧化氮与前列腺素-2、减少Glu释放、加快细胞内Ca2+离子向细胞外转运以降低细胞内浓度、提高抗氧化酶活性、抑制氧自由基的形成等作用。但其对RIB的治疗作用机制尚缺乏支持研究。血清基质金属蛋白酶（MMPs）是一组依赖钙、锌离子的中性蛋白酶，其主要功能是降解细胞外基质，它参与了继发性脑损伤的病理过程，有研究表明，脑卒中患者MMP-9浓度水平增高[4]，梗阻面积越大其MMP-9的水平约高[5]，且这种表现与近期预后有一定的提示意义[6]，据此，我们推测RIB后有可能使MMP-9的表达增加。本实验通过观察消旋-3-正丁苯酞对RIB大鼠海马组织MMP-9表达水平的影响，为丁苯酞的保护作用及机制做出解释，为临床治疗提供理论与实践依据。目的通过对对照、模型以及采用不同剂量消旋-3-正丁苯酞治疗的放射性脑损伤大鼠学习与记忆能力和海马组织基质金属蛋白酶-9表达量的比较，研究丁苯酞对RIB脑组织的保护性作用的机制，为临床治疗提供理论基础。研究方法采用健康雄性Wistar大鼠160只（12-16周龄），每只体重约250-300g，随机分为四个组，每组40只，分别为阴性对照组、丁苯酞治疗A组、丁苯酞治疗B组、阳性对照组。阴性对照组不接受放射线照射，也不进行任何腹腔注射。其余三组均接受同等剂量的放射线照射，之后，丁苯酞治疗A组给予6mg/kg的丁苯酞注射液腹腔注射；丁苯酞治疗B组给予2mg/kg的丁苯酞注射液腹腔注射；放射性脑损伤组给予等量安慰剂生理盐水腹腔注射。在给药后的不同时间点（1d、3d、5d、7d、14d和30d），每组随机选取3只大鼠，麻醉后打开胸腔，暴露心脏，先用生理盐水心脏灌注，随后应用4%多聚甲醛心脏灌注，待灌注完全后断头剥离完整的脑组织，并冠状位切取视交叉后1mm及4mm之间含有海马的脑组织，经多聚甲醛固定、沉糖过夜后制成冰冻切片，抗原修复后行HE染色和免疫组化染色观察MMP-9的表达并进行MMP-9免疫组化染色灰度值分析。各组剩余大鼠120d后行Morris水迷宫试验与跳台逃避实验，记录实验数据，检测并比较各组大鼠学习记忆与能力。实验数据运用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析，采用LSD-t检验进行各组间的比较，以P<0.05为有统计学意义。结果1.实验大鼠一般情况阴性对照组大鼠精神状态良好，活动多，行动敏捷，进水饮食良好，反应迅速；阳性对照组大鼠精神状态萎靡，活动少，反应迟钝，进食饮水减少；丁苯酞治疗组大鼠（包括丁苯酞治疗A组和丁苯酞治疗B组）在造模成功后的2-3天后精神、活动、反应和饮食逐渐恢复，约一周左右恢复正常。其中，丁苯酞治疗A组大鼠比丁苯酞治疗B组大鼠精神、活动、反应速度和饮食量恢复速度稍快。2. Morris水迷宫试验各组大鼠实验的第31天分别进行Morris水迷宫测试和跳台逃避实验测试以检测其学习能力。并以两个实验大鼠的逃避潜伏期和错误次数作为实验数据，本组数据反应了大鼠的学习能力；一天之后进行Morris水迷宫实验和跳台逃避实验测试各组大鼠记忆能力。以Morris水迷宫大鼠原平台象限停留时间及路径长度以及跳台逃避实验的逃避潜伏时间和错误次数作为实验数据以反应大鼠的记忆能力。最后将各组第31天的测试数据于32天的测试数据进行比较分析，观察各组大鼠学习与记忆能力的不同。水迷宫试验：在学习能力试验中，与阳性对照组相比，丁苯酞治疗A组和丁苯酞治疗B组的逃避潜伏时间明显缩短，分别为(79.61±7.17，43.64±4.72，42.15±4.19）秒，错误次数明显减少（P<0.01），分别为（36.43±6.59，14.58±4.22，13.66±3.91）；在记忆能力试验中，与阳性对照组相比，丁苯酞治疗组的原平台象限停留时间明显长于阳性对照组（P<0.01），分别为（17.57±4.29，30.09±3.68，31.25±3.17）秒，游泳速度明显增快（P<0.01）,分别为（10.09±3.67，17.36±2.11，18.18±2.09）。3.跳台逃避实验：在检测学习能力的试验中，与阳性对照组相比，丁苯酞治疗A组和丁苯酞治疗B组的跳台逃避潜伏期明显缩短，分别为（56.86±10.28，56.08±10.16，84.13±11.51）秒，错误次数明显减少（P<0.01），分别为（2.06±0.42，2.05±0.38，4.75±0.76）；在检测记忆能力的试验中，与阳性对照组相比，丁苯酞治疗A组和丁苯酞治疗B组的原平台象限停留时间明显延长（P<0.01），分别为（143.09±10.38，142.17±10.5，62.74±9.06）秒，停留时间明显延长（P<0.01）,分别为（0.52±0.03，0.5±0.02，1.83±0.1）。4.HE染色结果阴性对照组：神经元细胞水肿及变形坏死现象部明显，细胞核圆而大，细胞排列规则整齐，边缘规整，与周围神经元细胞界限分明、清楚；阳性对照组：神经元细胞水肿及变形坏死现象明显，细胞核固缩、碎裂，甚至细胞核溶解、消失；丁苯酞治疗组：神经元细胞水肿及变性坏死现象较阴性对照组明显减轻，神经元细胞结构清晰完整，细胞膜破裂现象较少，边缘规整，受损的神经元数量较阳性对照组明显减少，丁苯酞治疗A组的神经元细胞水肿现象较丁苯酞治疗B组为轻。5.MMP-9的免疫组化染色对1d、5d、15d、30d、60d和90d接收电子束颅脑照射的大鼠进行水合氯醛的腹腔注射麻醉，应用4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，把脑组织放入多聚甲醛溶液中进行固定，沉糖过夜，把脑组织用切片机切成冰冻切片，采用SP法行免疫组化染色，观察MMP-9表达的影响。用图像采集系统采图，用图像分析软件对图像进行比较分析，应用统计学软件对图像进行分析计算。阳性对照组的MMP-9表达明显减少，丁苯酞治疗B组MMP-9的表达增加，丁苯酞治疗A组MMP-9的表达程度比丁苯酞治疗B组大。结论1.丁苯酞可增加RIB模型大鼠在跳台回避试验和Morris水迷宫试验中的学习记忆能力。2.阳性对照组大鼠海马神经细胞的MMP-9表达明显增加。3.丁苯酞可使MMP-9的表达明显减少。4.丁苯酞对MMP-9的表达的影响有可能是丁苯酞对RIB的治疗靶点之一。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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