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作者

李雪芳

学位名称

硕士

导师姓名

亓建洪

学位年度

2015

学位授予单位

泰山医学院

关键词

关节软骨组织 细胞活性 体外培养保存 wnt信号通路 β-catenin信号通路

摘要

通过调控干预wnt/β-catenin信号通路，检测信号通路关键蛋白β-catenin、GSK3β，以及凋亡蛋白caspase-3的表达变化，探讨体外培养保存关节软骨组织活性与wnt/β-catenin信号通路的相关性，找到阻断培养保存关节软骨凋亡的靶点，为提高培养保存关节软骨组织活性提供实验依据。 方法： 取20只健康成年长枫白猪，40个后膝关节，雌雄不限，无明显关节病变。实验动物麻醉处死后，立即离断后膝关节，两小时内在低温环境下运送至无菌实验室。无菌条件下行膝关节正中切口，暴露并横断髌韧带，切断前后交叉韧带，暴露关节面，在股骨髁负重面上用专用软骨移植器械切取直径7mm、长10mm的圆柱形骨软骨块225枚，投入无菌器皿中，无菌PBS缓冲液冲洗3遍。根据培养液成分的不同随机分为三组，每组75枚：A组基础保存液组（无菌MEME培养液+100u/ml的青链霉素，PH值7.2～7.4)；B组：基础保存液中添加浓度为10μmol／L Kenpaullone的抑制剂组；C组：基础保存液添加浓度为10μmol／L SB-216763的增强剂组。在37℃、5％CO2培养箱保存，隔日换液一次，分别于保...更多

通过调控干预wnt/β-catenin信号通路，检测信号通路关键蛋白β-catenin、GSK3β，以及凋亡蛋白caspase-3的表达变化，探讨体外培养保存关节软骨组织活性与wnt/β-catenin信号通路的相关性，找到阻断培养保存关节软骨凋亡的靶点，为提高培养保存关节软骨组织活性提供实验依据。 方法： 取20只健康成年长枫白猪，40个后膝关节，雌雄不限，无明显关节病变。实验动物麻醉处死后，立即离断后膝关节，两小时内在低温环境下运送至无菌实验室。无菌条件下行膝关节正中切口，暴露并横断髌韧带，切断前后交叉韧带，暴露关节面，在股骨髁负重面上用专用软骨移植器械切取直径7mm、长10mm的圆柱形骨软骨块225枚，投入无菌器皿中，无菌PBS缓冲液冲洗3遍。根据培养液成分的不同随机分为三组，每组75枚：A组基础保存液组（无菌MEME培养液+100u/ml的青链霉素，PH值7.2～7.4)；B组：基础保存液中添加浓度为10μmol／L Kenpaullone的抑制剂组；C组：基础保存液添加浓度为10μmol／L SB-216763的增强剂组。在37℃、5％CO2培养箱保存，隔日换液一次，分别于保存的5个时间点，即第1、14、21、28、35天时各取一组关节软骨，进行如下检测：Safranin O染色、EB/FDA荧光染色测软骨细胞的存活率；免疫组化检测β-catenin、GSK3β的蛋白表达；AnnexinV-PI双染测软骨细胞的凋亡；Western blot法观察GSK3β蛋白质磷酸化水平及caspase-3的表达。统计学进行分析，组间比较应用卡方检验，样本均数的比较应用t检验，以P≤0.05有统计学意义。数据均应用单因素的方差分析来进行统计学的处理。 结果： 1、软骨细胞存活率： 软骨细胞存活率整体的趋势是逐渐降低的，A组、B组、C组三组在保存第1天时，存活率差异较小，无统计学意义。保存第14天时，B组保持在90%左右，其余两组均低于90%，且组间比较有统计学意义（P＜0.05）。保存第21天时，各组软骨细胞的存活率分别为：A组：80.40±2.07%，B组：83.60±2.30&，C组：77.00±2.23%，组间比较有统计学意义（P＜0.05）。保存第28天时，存活率B组＞A组＞C组，组间差异有意义。保存第35天时，B组存活率仍高于其余两组。组间比较有统计学意义（P＜0.05）。 2、软骨细胞凋亡率及凋亡蛋白caspase3的表达情况： 软骨细胞的凋亡率整体随培养保存时间的延长而增加，凋亡蛋白的含量也是逐渐增加的。两指标在保存第1天时组间比较均无统计学意义。保存第14天时，A、B、C三组凋亡率分别为12.75±0.40%，11.18±0.48%，16.70±0.37%，C组凋亡最多，组间比较有统计学意义（P＜0.05）。凋亡蛋白caspase3的含量表现为C组＞A组＞B组。保存第21天时，A、C组凋亡均高于20%，B组较低，组间比较有统计学意义。凋亡蛋白caspase3的含量也明显增加，趋势和凋亡率一致。保存第28天时，A、B、C三组分别为30.44±0.79%，27.54±0.59%，36.36±0.68%，组间比较有意义（P＜0.05）。凋亡蛋白caspase3仍C组含量居多，组间比较有意义。保存第35天时，A、C组均在40%以上。B组维持较低的凋亡率，组间比较有统计学意义。凋亡蛋白caspase3差异明显，同样B组含量最低，三组间比较有意义（P＜0.05）。 3、Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白GSK3β、β-catenin的表达情况： 对GSK3β主要应用免疫组化法、western blot法检测，两种检测方法结果整体趋势一致。β-catenin应用免疫组化法检测。保存第1天各指标差异不明显，无意义。保存第14、21、28、35天，GSK3β的含量在各组整体都是逐渐增加的，每个时间点组间比较，抑制剂B组GSK3β的含量均高于其余两组，增强剂C组GSK3β的含量居于较低的水平（P＜0.05）。β-catenin的含量在保存过程中逐渐增加，其中各时间点组间比较：增强剂C组的含量高于对照组A组和抑制剂B组（P＜0.05）。 4、蛋白多糖（PG）组织化学染色情况： 保存第1天时，各组无明显差异，统计学无意义。保存第14天时，以B组IOD值最高，A组次之，C组最低，组间比较差异有统计学意义（P 5、存活率、凋亡率、凋亡蛋白caspase3与GSK3β、β-catenin表达的相关性： 软骨细胞存活率与凋亡率、凋亡蛋白caspase3、GSK3β、β-catenin的表达负性相关。凋亡率与凋亡蛋白caspase3、GSK3β、β-catenin的表达正相关。凋亡蛋白caspase3的含量与GSK3β、β-catenin的表达正相关。β-catenin的表达与GSK3β的表达正相关。 结论： 1、通过调控干预wnt/β-catenin信号通路可以对培养保存的软骨组织活性产生影响。 2、10μmol／L的通路抑制剂Kenpaullone在培养保存关节软骨的过程中抑制wnt/β-catenin信号通路，导致软骨细胞凋亡的减少。 3、10μmol／L的通路激活剂SB-216763在培养保存关节软骨的过程中激活wnt/β-catenin信号通路，导致软骨细胞凋亡的增加。 意义： 本实验通过组织培养法保存关节软骨组织，通过研究组织培养保存的关节软骨组织活性与wnt/β-catenin信号通路的关系，证实了调控干预wnt/β-catenin信号通路可以对关节软骨组织的活性产生影响。为探索培养保存关节软骨组织wnt/β-catenin信号通路的凋亡靶点提供了实验依据。收起

文献类型

学位论文

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