目的应用RNA-seq技术构建扩张型心肌病患者和健康对照外周血单核细胞的lncRNA/mRNA差异性表达谱。应用生物信息学手段分析DCM的lncRNA/mRNA差异性表达谱,探讨疾病发生发展的分子机制。随机挑选差异表达的lncRNAs,应用RT-PCR验证方法证实RNA-seq检测结果。本实验旨在从基因表达水平上探讨扩张型心肌病的分子机制。方法入选于2015年7月至2016年5月在聊城市人民医院确诊为扩张型心肌病并住院应用药物治疗的8例患者作为病例组,并入选与病例组相匹配的8例健康人作为正常对照组。防凝负压管分别采集两组外周静脉血,离心、分离获得外周血单核细胞。RNA抽提、质控合格后,使用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit预处理RNA,构建测序文库。经过Illumina HiSeq测序仪测序,获得原始数据,使用cuffdiff软件获得基因水平的lncRNA/mRNA FPKM值,作为lncRNA/mRNA表达谱,通过计算两组样品间的倍数变化和p-value,获得差异lncRNA/mRNA表达谱。应用基于GO和KEGG数据库的DAVID在...更多
目的应用RNA-seq技术构建扩张型心肌病患者和健康对照外周血单核细胞的lncRNA/mRNA差异性表达谱。应用生物信息学手段分析DCM的lncRNA/mRNA差异性表达谱,探讨疾病发生发展的分子机制。随机挑选差异表达的lncRNAs,应用RT-PCR验证方法证实RNA-seq检测结果。本实验旨在从基因表达水平上探讨扩张型心肌病的分子机制。方法入选于2015年7月至2016年5月在聊城市人民医院确诊为扩张型心肌病并住院应用药物治疗的8例患者作为病例组,并入选与病例组相匹配的8例健康人作为正常对照组。防凝负压管分别采集两组外周静脉血,离心、分离获得外周血单核细胞。RNA抽提、质控合格后,使用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit预处理RNA,构建测序文库。经过Illumina HiSeq测序仪测序,获得原始数据,使用cuffdiff软件获得基因水平的lncRNA/mRNA FPKM值,作为lncRNA/mRNA表达谱,通过计算两组样品间的倍数变化和p-value,获得差异lncRNA/mRNA表达谱。应用基于GO和KEGG数据库的DAVID在线工具对DCM基因差异性表达谱行生物学功能研究和通路富集分析。并通过计算差异表达的lncRNAs、mRNAs和Pearson的相关系数,构建lncRNA-mRNA共表达网络图。随机挑选5条差异表达的lncRNAs,在扩大样本行RT-PCR验证,各样品的目标RNA和内参分别应用2×PCR master mix进行Real time PCR反应。结果入选的病例组和对照组的8对样本经NanoDrop ND-2000仪、变性琼脂糖凝胶电泳检测质控合格。应用RNA-seq技术获得原始数据,经质控、去低表达reads、标准化处理后,初步获得了扩张型心肌病组和正常对照组的lncRNA/mRNA表达谱,共检测到88768条lncRNAs、20315条mRNAs。经过统计学分析,发现两组lncRNAs/mRNAs存在明显的差异性表达,共发现988条差异表达的lncRNAs,1418条差异表达的mRNAs。聚类分析提示样本组间基因表达趋势一致。差异表达mRNAs GO分析结果:在生物学过程方面,差异表达的mRNAs在positive regulation of muscle tissue development、positive regulation of striated muscle tissue development、positive regulation of musc-le organ development富集程度最高,在细胞组分方面,差异表达的mRNAs在proton-transporting V-type ATPase、V0 domain、proton-transporting two-sector ATPase complex、proton-transporting domain、proton-transporting ATP synthase complex、coupling factor F富集程度最高,在分子功能方面,差异表达的mRNAs在MHC protein complex binding、MHC class II protein complex binding富集程度最高。KEGG通路富集分析结果:差异表达的基因主要富集在17个生物学途径中,其中Wnt signaling pathway与心脏心室重构、心肌肥大、心力衰竭等过程密切相关。计算差异表达的lncRNAs和mRNAs之间的相关系数,构建lncRNA-mRNA共表达网络图。在扩大样本中,PCR结果与RNA-seq结果基本一致。结论RNA-seq结果提示扩张型心肌病患者与正常对照相比存在基因的差异性表达。GO分析显示扩张型心肌病患者在能量代谢、心肌发育、细胞离子稳态失衡等生物学功能上与正常对照组相比有显著差别。生物学通路分析发现差异表达的基因在17条生物学信号通路中显著富集,其中Wnt信号通路与扩张型心肌病的发生发展明显相关。初步构建扩张型心肌病发生发展的基因调控网络,高节点度的lncRNA可能为潜在的基因治疗靶点。随机选取的lncRNAs在扩大样本中存在差异表达,与RNA-seq结果一致。进一步表明RNA-seq技术是一种定量准确、可重复性高、检测范围广、分析可靠的高通量、高效率检测手段。收起
