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作者

李宁

学位名称

硕士

导师姓名

赵雪梅

学位年度

2020

学位授予单位

山东第一医科大学

关键词

肝癌 DNA损伤 RECQL4解旋酶 五羟色胺受体抑制剂

分类号

R735.7

摘要

目的 针对RECQL4特异性表达肝癌对化疗药物顺铂的耐药性，本课题分为两部分实验：1.探讨5-HT受体抑制剂PRX、APZ、MET、SB与Cis联合用药，是否能增强Cis的抗肝癌效果及减弱肝癌对Cis的耐药性，旨在为HCC的临床治疗提供新的治疗思路和理论实验依据；2.以RECQL4蛋白为靶点，进行小分子抑制剂的筛选，以期筛选得到针对RECQL4蛋白具有靶向抑制作用的先导化合物。方法 1.采用WesternBlot技术筛选出RECQL4高表达的HCC细胞株；通过siRNA转染技术构建RECQL4沉默的细胞株；采用CCK8法检测PRX、APZ、MET、SB与Cis单独用药、联合用药对SNU398细胞增殖的影响；应用Chou-Talalay方程原理、利用CompuSyn软件评价联合用药的作用；运用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；通过向BALB/C-Nu裸鼠皮下注射SNU398细胞，构建裸鼠异体移植瘤模型；待肿瘤体积大约为100~150mm3时，将裸鼠分为DMSO组、APZ组、Cis组、APZ+Cis组；称量各组裸鼠肿瘤的质量，评估裸鼠的生存时间、分析裸鼠的脏器系数，检测不...更多

目的 针对RECQL4特异性表达肝癌对化疗药物顺铂的耐药性，本课题分为两部分实验：1.探讨5-HT受体抑制剂PRX、APZ、MET、SB与Cis联合用药，是否能增强Cis的抗肝癌效果及减弱肝癌对Cis的耐药性，旨在为HCC的临床治疗提供新的治疗思路和理论实验依据；2.以RECQL4蛋白为靶点，进行小分子抑制剂的筛选，以期筛选得到针对RECQL4蛋白具有靶向抑制作用的先导化合物。方法 1.采用WesternBlot技术筛选出RECQL4高表达的HCC细胞株；通过siRNA转染技术构建RECQL4沉默的细胞株；采用CCK8法检测PRX、APZ、MET、SB与Cis单独用药、联合用药对SNU398细胞增殖的影响；应用Chou-Talalay方程原理、利用CompuSyn软件评价联合用药的作用；运用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；通过向BALB/C-Nu裸鼠皮下注射SNU398细胞，构建裸鼠异体移植瘤模型；待肿瘤体积大约为100~150mm3时，将裸鼠分为DMSO组、APZ组、Cis组、APZ+Cis组；称量各组裸鼠肿瘤的质量，评估裸鼠的生存时间、分析裸鼠的脏器系数，检测不同给药组的药物对肿瘤生长的抑制效果及评估对裸鼠生存时间的影响； 2.以RECQL4为靶点进行计算机辅助药物设计和虚拟筛选，在SPECS和ChemDiv化合物库中筛选化合物；利用原核表达系统在大肠杆菌BL-21中表达RECQL4蛋白；利用BCA法测定蛋白浓度；采用FRET法检测化合物对RECQL4蛋白Helicase酶活性的影响；采用CCK8法检测抑制剂对RECQL4高表达肝癌细胞株的抑制作用。 结果 1.以LO2细胞为对照，筛选出RECQL4高表达的肝癌细胞株SNU398，并且得到了RECQL4沉默的细胞株siSNU398； 以LO2细胞为对照，PRX、APZ、MET、SB与Cis单独用药、联合用药对SNU398细胞均呈现了抑制作用，并且联合用药组的抑制率均高于Cis组，呈剂量-效应关系；PRX与Cis联合用药，CI值＜1，呈现了协同作用；APZ与Cis在小剂量联合时，CI值＜1，呈现了协同作用，大剂量联合时，CI值＞1，呈现了拮抗作用；MET与Cis在小剂量联合时，CI值＞1，呈现了拮抗作用，随着用药浓度的增大，逐渐呈现协同作用；SB与Cis在小剂量联合时，CI值＞1，呈现了拮抗作用，大剂量联合时，CI值＜1，呈现了协同作用。 与SNU398细胞相比，PRX、APZ、MET、SB与Cis单独用药、联合用药对siSNU398均呈现了更高的抑制作用，RECQL4沉默后siSNU398对药物的敏感性更高。 以LO2细胞为对照，选择PRX与Cis单独用药、联合用药对SNU398细胞进行药物干预，通过流式细胞仪检测出Cis组、PRX+Cis组诱导SNU398的凋亡率明显低于LO2的凋亡率，尤其在晚期凋亡中更加明显，RECQL4高表达肝癌细胞对药物的耐受性较高。 与DMSO对照组相比，Cis组、APZ+Cis组对肿瘤生长具有较好的抑制作用，抑制率分别为82.33%、91.23%；通过生存周期和脏器系数分析，与Cis组相比，APZ+Cis组延长了裸鼠的生存周期、一定程度上减弱了Cis的药物毒性； 2.通过计算机辅助设计和虚拟筛选，以RECQL4蛋白为靶点，我们在SPECS和ChemDiv两个化合物库中，筛选得到了与RECQL4蛋白互相作用的53个化合物。 通过SDS-PAGE凝胶电泳条带分析，我们在大肠杆菌BL-21中表达RECQL4蛋白并进行了表达条件的优化，通过BCA法测得RECQL4蛋白浓度为3.002±0.013mg/ml。 荧光链Cy3与淬灭单链BHQ2结合比例为1∶3，即Cy3浓度为200nM，BHQ2浓度为600nM时，为最佳的底物浓度；RECQL4蛋白浓度为4100nM，为最佳的蛋白浓度；在此最佳条件下，测得RECQL4蛋白Helicase酶活性，在53个化合物中筛选得到21个化合物对Helicase酶活性具有抑制作用，其中4、6、11、16这四个化合物的对Helicase酶活性的抑制活性较好； 以LO2细胞为对照，21个抑制剂对肝癌细胞SNU398、Huh7、SNU449、SNU387进行干预，4、6、7、8、9、11、15、16这八个化合物对HCC细胞的增殖均呈现了较高的抑制作用，其中6、11、16这三个化合物对RECQL4特异性表达的HCC细胞具有选择性抑制作用。 综合在Helicase酶水平和细胞水平的抑制作用，我们选择了6、11、16这三个化合物做为先导化合物，进行下一步的结构修饰和衍生化。 结论 1.PRX、APZ、MET、SB与Cis联合用药能够降低Cis的用量、增强Cis的抗肝癌效果以及减弱Cis的毒副作用。RECQL4沉默后siSNU398对药物呈现了更高的敏感性； 2.以RECQL4为靶点筛选得到了6、11、16三个先导化合物。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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