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作者

张晓芬

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

周丽

学位年度

2012

学位授予单位

泰山医学院

关键词

冬凌草甲素 细胞凋亡 jurkat 细胞周期 caspase-3

分类号

R733.7;R285

摘要

目的冬凌草甲素(Oridonin)是一种从冬凌草植物（Rabdosa rubescens）中提取出来的具有生物学活性的四环二帖类化合物，研究发现它具有抗炎、抗菌和抗肿瘤的功效，冬凌草甲素对多种肿瘤细胞有不同程度的抑制作用，但对急性T淋巴细胞白血病的研究鲜有报道，本实验采用急性T淋巴细胞白血病jurkat细胞作为体外实验研究的对象，探讨冬凌草甲素（oridonin）单用及联合柔红霉素（DNR）对jurkat细胞的增殖抑制、促凋亡作用并对冬凌草甲素诱导jurkat细胞凋亡机制的研究进行初步的探讨，为临床治疗急性T淋巴细胞白血病的新药开发利用提供一定的实验依据。方法采用CCK-8检测冬凌草甲素单用及联合化疗药物柔红霉素作用于jurkat细胞24h、48h、72h后的增殖抑制作用；利用相差显微镜、Giemsa染色、罗丹明123荧光染色观察冬凌草甲素作用于jurkat细胞48h后的形态学变化；AnnexinV-FITC/PI双染法检测冬凌草甲素单用及联合化疗药物柔红霉素作用于jurkat细胞48h后凋亡的影响；为进一步明确冬凌草甲素诱导jurkat细胞凋亡的部分作用机制，在第二部分实验中采用流式...更多

目的冬凌草甲素(Oridonin)是一种从冬凌草植物（Rabdosa rubescens）中提取出来的具有生物学活性的四环二帖类化合物，研究发现它具有抗炎、抗菌和抗肿瘤的功效，冬凌草甲素对多种肿瘤细胞有不同程度的抑制作用，但对急性T淋巴细胞白血病的研究鲜有报道，本实验采用急性T淋巴细胞白血病jurkat细胞作为体外实验研究的对象，探讨冬凌草甲素（oridonin）单用及联合柔红霉素（DNR）对jurkat细胞的增殖抑制、促凋亡作用并对冬凌草甲素诱导jurkat细胞凋亡机制的研究进行初步的探讨，为临床治疗急性T淋巴细胞白血病的新药开发利用提供一定的实验依据。方法采用CCK-8检测冬凌草甲素单用及联合化疗药物柔红霉素作用于jurkat细胞24h、48h、72h后的增殖抑制作用；利用相差显微镜、Giemsa染色、罗丹明123荧光染色观察冬凌草甲素作用于jurkat细胞48h后的形态学变化；AnnexinV-FITC/PI双染法检测冬凌草甲素单用及联合化疗药物柔红霉素作用于jurkat细胞48h后凋亡的影响；为进一步明确冬凌草甲素诱导jurkat细胞凋亡的部分作用机制，在第二部分实验中采用流式细胞仪检测冬凌草甲素作用于jurkat细胞48h后的周期分布变化；罗丹明123检测冬凌草甲素作用于jurkat细胞48h后的荧光强度；caspase-3酶活性检测冬凌草甲素作用于jurkat细胞48h后的caspase-3酶活性变化。结果1、CCK-8检测jurkat细胞的增值抑制作用CCK-8试剂盒检测表明相同时间下，随着药物浓度的增加，吸光度值逐渐降低；相同药物浓度下，随着作用时间的延长，吸光度值逐渐减低，表明冬凌草甲素对jurkat细胞的作用呈现一定的剂量-时间依赖性。取对jurkat细胞抑制作用最弱的1ug/ml柔红霉素联合不同浓度的冬凌草甲素共同作用于jurkat细胞，其抑制作用高于单用柔红霉素及冬凌草甲素，且差异具有统计学意义（P<0.05），金氏公式判断冬凌草甲素联合柔红霉素对jurkat细胞具有协同抑制效应。2、细胞形态学观察相差显微镜下，随着药物浓度的增加，细胞密度逐渐减低，边缘不清，亮度逐渐减弱，呈现膜皱缩、核破裂等溶解性坏死等变化；Giemsa染色观察空白对照组细胞边缘光滑，染色质紫红色，伴随药物浓度的增加，胞膜皱缩，细胞核边集，空泡变性、染色质密集浓染，部分观察到凋亡小体等凋亡形态学变化；罗丹明123染色观察随着药物浓度的增加，jurkat细胞呈现胞体萎缩，细胞荧光染色强度减弱等表现。3、AnnexinV-FITC/PI双染法检测药物对jurkat细胞的凋亡率流式细胞仪检测结果显示：不同浓度的冬凌草甲素（1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml）处理组作用于jurkat细胞48h后的凋亡率分别为7.74±0.96%、13.26±1.49%、17.42±1.24%、25.13±2.12%、29.07±0.59%，与空白对照组相比差异具有统计学意义，柔红霉素最低诱导凋亡浓度（0.04μg/ml）联合接近IC50浓度的冬凌草甲素（4μg/ml）共同作用于jurkat细胞48h,其凋亡率明显高于单用柔红霉素、冬凌草甲素的凋亡率，差异具有统计学意义。4、冬凌草甲素对细胞周期分布变化的影响流式细胞仪检测表明：不同浓度的冬凌草甲素（1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml）处理组作用于jurkat细胞48h后，随着药物浓度的增加，G1期细胞比例分别为33.96±1.15%、36.04±0.30%、37.05±0.18%、37.59±0.76%、38.77±1.58%、47.71±4.94%，其中8μg/ml、16μg/ml冬凌草甲素处理组与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；S期细胞呈减少趋势，各浓度处理组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05)。实验表明冬凌草甲素影响细胞周期分布，可诱导jurkat细胞阻滞于G1期。5、罗丹明123检测冬凌草甲素对jurkat细胞膜电位的影响FCM检测表明：随着药物浓度的增加，荧光强度呈浓度依赖性降低，各浓度处理组的荧光强度分别为3806.79±186.30、3516.43±223.86、3072.41±28.52、665.82±85.39、193.08±3.70，与空白对照组相比，除第一处理组外，差异具有统计学意义（F=302.584，P<0.05），实验表明冬凌草甲素可诱导jurkat细胞膜电位降低，是冬凌草甲素诱导jurkat细胞凋亡的机制之一。6、caspase-3活性检测冬凌草甲素对jurkat细胞caspase-3酶活性变化不同浓度的冬凌草甲素（1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml）处理组作用于jurkat细胞48h后，随着药物浓度的增加，吸光度值分别为0.162±0.005、0.169±0.004、0.179±0.015、0.190±0.008、0.203±0.155与空白对照组相比，差异具有统计学意义。实验表明随着药物浓度增加吸光度值呈现浓度依赖性增加，间接反映caspase-3酶活性逐渐增高。结论1、冬凌草甲素对jurkat细胞具有增殖抑制作用，该作用具有一定的时间-剂量依赖性；当冬凌草甲素联合化疗药物柔红霉素时对jurkat细胞具有协同抑制作用，提示冬凌草甲素本身可作为一种新型抗肿瘤药物在抑制白血病细胞生长、诱导其凋亡的同时，还可以作为化疗药物的辅助用药，增强化疗药物对白血病细胞的敏感性、降低用药量及其副作用。2、冬凌草甲素对jurkat细胞的杀伤作用主要是通过诱导细胞凋亡实现的，其机制主要如下：影响细胞周期分布，将细胞阻滞于G1期，周期阻滞作用呈现一定的剂量依赖性，从而有效控制细胞增殖；线粒体跨膜电位（ΔΨm）的降低呈一定的剂量依赖性，其降低程度反映线粒体膜受损的程度，是细胞凋亡的早期事件，反映细胞进入不可逆的凋亡程序。Caspase-3是caspase蛋白家族执行细胞凋亡的最强大凋亡效应因子及最终凋亡执行者，激活caspase-3酶活性，呈剂量依赖性，参与到细胞凋亡级联反应，最终诱导细胞凋亡。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

浏览量

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