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作者

窦征岳

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

江其生

学位年度

2011

学位授予单位

泰山医学院

关键词

阿霉素 顺铂 肺癌 钙网织蛋白 树突状细胞 免疫原性 凋亡

分类号

R73-36

摘要

目的:传统观念认为化疗药物对免疫治疗有抑制作用,但主要化疗药物如阿霉素等导致肿瘤细胞凋亡或死亡后能否刺激机体免疫细胞,如树突状细胞(dendritic cell,DC)等从而启动机体细胞免疫反应并产生杀伤肿瘤效应,尚需研究。为此,本课题以阿霉素、顺铂诱发A549细胞凋亡,并以早期凋亡的A549细胞为抗原,体外刺激DC,致敏T细胞,观察其对培养的A549细胞的杀伤效应,并初步探讨其作用机制,为临床化疗联合以树突状细胞为主的免疫治疗新模式的研究和应用提供实验依据。方法:用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)法检测经阿霉素及顺铂处理后A549细胞的凋亡率。MTT法检测细胞数量。DC细胞的制备:采取外周血经密度梯度离心法最终获得单个核细胞,细胞贴壁培养,加细胞因子白介素-4(IL-4),粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF),培养至第3天和第10天时,以流式细胞仪分别检测细胞表面CD80、CD83表达情况,以证实是否已成为成熟的DC。以激光共聚焦显微镜观察化疗后A549细胞表面钙网织蛋白暴露情况。结果:1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L阿霉素与A549细胞孵育12 h后,A549细胞凋亡率(%...更多

目的:传统观念认为化疗药物对免疫治疗有抑制作用,但主要化疗药物如阿霉素等导致肿瘤细胞凋亡或死亡后能否刺激机体免疫细胞,如树突状细胞(dendritic cell,DC)等从而启动机体细胞免疫反应并产生杀伤肿瘤效应,尚需研究。为此,本课题以阿霉素、顺铂诱发A549细胞凋亡,并以早期凋亡的A549细胞为抗原,体外刺激DC,致敏T细胞,观察其对培养的A549细胞的杀伤效应,并初步探讨其作用机制,为临床化疗联合以树突状细胞为主的免疫治疗新模式的研究和应用提供实验依据。方法:用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)法检测经阿霉素及顺铂处理后A549细胞的凋亡率。MTT法检测细胞数量。DC细胞的制备:采取外周血经密度梯度离心法最终获得单个核细胞,细胞贴壁培养,加细胞因子白介素-4(IL-4),粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF),培养至第3天和第10天时,以流式细胞仪分别检测细胞表面CD80、CD83表达情况,以证实是否已成为成熟的DC。以激光共聚焦显微镜观察化疗后A549细胞表面钙网织蛋白暴露情况。结果:1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L阿霉素与A549细胞孵育12 h后,A549细胞凋亡率(%)分别为17.6±1.77,62.93±1.70,16.8±0.65。9 mg/L、13 mg/L、21 mg/L顺铂与A549细胞孵育12 h后,A549细胞凋亡率(%)分别为52.99±8.39,62.44±3.41,47.14±8.99。表明阿霉素及顺铂均可诱导A549细胞凋亡, 3 mg/L阿霉素和13 mg/L顺铂处理12 h后A549细胞凋亡率较高,且二组相近(P>0.05),故在后续试验中分别以3 mg/L阿霉素和13 mg/L顺铂来诱导A549细胞凋亡。以3 mg/L阿霉素处理的早期凋亡A549细胞为A组,13 mg/L顺铂处理的早期凋亡A549细胞为D组,正常培养的A549细胞为N组(对照组),分别体外刺激培养的DC细胞并致敏T细胞,以MTT法检测致敏T细胞对A549细胞杀伤力,结果为:A组OD值为0.6245±0.031715,D组OD值为0.8745±0.032569,N组OD值为0.922627±0.041501,A组与其它两组比较,均有统计学差异(P<0.01),说明阿霉素处理的A549细胞具有较强的免疫原性,能诱发较强的细胞免疫反应从而杀伤更多肿瘤细胞。分离的外周血单个核细胞在体外经IL-4、GM-CSF等细胞因子刺激后,培养至第3天,以流式细胞仪检测细胞膜表面相关蛋白,检测结果CD80为24.67%;CD83为31.13%。培养至第10天,A组抗原刺激的DC的CD80,CD83分别为81.48%、77.40%;D组抗原刺激的DC的CD80,CD83分别为80.82%,91.61%;N组抗原刺激的DC的CD80,CD83分别为83.89%、94.71%。上述结果提示,培养10 d后DC细胞表面CD80,CD83表达显著增加。CD80为共刺激分子,可诱导T细胞的增殖、活化,CD83是树突状细胞的特异性标志,参与抗原递呈和淋巴细胞活化。镜下形态观察:细胞培养初期可见条形、分枝状细胞,细胞贴壁;培养后期,悬浮的细胞明显增多,以散在的细胞为主,细胞体积增大,细胞表面可见毛刺状的突起,呈不规则的树突状。上述细胞表面标记物检测和细胞形态学改变说明培养的细胞为树突状细胞,且培养至第10天时已处于成熟状态。以免疫学技术和激光共聚焦显微镜观察A549细胞表面钙网织蛋白表达情况,结果发现经阿霉素处理的A549细胞表面可见钙网织蛋白出现,顺铂处理的A549细胞及非处理的对照组A549细胞表面未见钙网织蛋白出现。表明经阿霉素处理的A549细胞表面有钙网织蛋白暴露,这可能与阿霉素较顺铂能诱发更强免疫原性有关。进一步将钙网织蛋白阻断剂加入阿霉素处理的A549细胞中,在与A组相同条件下,检测其对A549细胞杀伤效应,结果显示该组OD值为:0.770727±0.006191,高于A组(0.6245±0.031715),差异具有统计学意义(P<0.01),说明以钙网织蛋白阻断剂来阻断细胞膜上暴露的钙网织蛋白与DC的结合,可降低阿霉素诱导的免疫原性,进一步证实阿霉素引起的A549细胞钙网织蛋白的暴露是其产生免疫原性的重要原因。结论:1、阿霉素及顺铂均可诱导A549细胞早期凋亡,呈非剂量依赖性。2、阿霉素诱导的早期凋亡A549细胞较顺铂诱导的早期凋亡A549细胞有较强的免疫原性。其发生机制与阿霉素处理的早期凋亡A549细胞细胞膜表面钙网织蛋白暴露有关。3、本实验发现的阿霉素可引起A549细胞钙网织蛋白暴露并产生免疫原性,为临床肿瘤患者应用化疗(阿霉素)联合免疫治疗新模式的研究和应用提供了新思路和实验依据。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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