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作者

王兴翠

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

马丽霞

学位年度

2010

学位授予单位

泰山医学院

关键词

糖蛋白 内质网应激 克隆表达 RNA干扰 细胞周期

分类号

R735.7

摘要

目的1.构建糖基转移酶KDELC1新基因的原核表达载体,诱导融合蛋白表达,并对其进行纯化,制备融合蛋白多克隆抗体。2.明确该糖基转移酶在肝细胞内的表达定位及组织分布。3.探讨KDELC1表达变化对HepG2细胞周期可能的调节作用。4.探讨内质网应激过程中该蛋白表达变化特征。5.探讨该蛋白在肝细胞损伤中的调节作用。方法1.克隆、表达KDELC1融合蛋白。应用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription PCR, RT-PCR)技术,以人肝母细胞瘤细胞系(HepG2细胞)为模板提取总RNA,反转录cDNA,扩增目的基因KDELC1的全长CDs,并将其克隆至pGEM-T-EASY载体,测序验证。随后将KDELC1全长片段插入原核表达载体pET-32a (+)中,转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3), IPTG诱导融合蛋白表达,分别通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和免疫印迹(Western blot)法,分析验证融合蛋白表达的特异性。随后大量诱导该蛋白表达,利用亲和层析法对表达蛋白进行纯化。2.制备KDELC1的多克隆抗体。以纯化的融合蛋白为抗原,免疫...更多

目的1.构建糖基转移酶KDELC1新基因的原核表达载体,诱导融合蛋白表达,并对其进行纯化,制备融合蛋白多克隆抗体。2.明确该糖基转移酶在肝细胞内的表达定位及组织分布。3.探讨KDELC1表达变化对HepG2细胞周期可能的调节作用。4.探讨内质网应激过程中该蛋白表达变化特征。5.探讨该蛋白在肝细胞损伤中的调节作用。方法1.克隆、表达KDELC1融合蛋白。应用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription PCR, RT-PCR)技术,以人肝母细胞瘤细胞系(HepG2细胞)为模板提取总RNA,反转录cDNA,扩增目的基因KDELC1的全长CDs,并将其克隆至pGEM-T-EASY载体,测序验证。随后将KDELC1全长片段插入原核表达载体pET-32a (+)中,转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3), IPTG诱导融合蛋白表达,分别通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和免疫印迹(Western blot)法,分析验证融合蛋白表达的特异性。随后大量诱导该蛋白表达,利用亲和层析法对表达蛋白进行纯化。2.制备KDELC1的多克隆抗体。以纯化的融合蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体。同时以免疫前后的兔血清作为一抗,利用Western blot技术和ELISA方法对多克隆抗体进行特异性分析和效价检测。3.构建KDELC1细胞内定位载体。扩增KDELC1全长CDs,将全长片段插入至绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,分别用双酶切、测序进行鉴定,从而构建KDELC1与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒pEGFP-C1-KDELC1。随后利用已构建的内质网居民蛋白calreticulin定位质粒pERFP-calrrticulin-N1,共转染HepG2细胞后,利用激光共聚焦显微术,观察分析KDELC1在细胞内的分布特征。4.分析KDELC1在组织中的分布特征。利用上述制备成功的KDELC1多克隆抗体,采用免疫组织化学技术,观察分析KDELC1在肝脏、肺、肾脏、脾脏、胃、乳腺、淋巴结、直肠组织中的分布特征。5.构建、筛选KDELC1干扰质粒。委托Inventrogen公司,构建KDELC1干扰质粒。将多对KDELC1干扰质粒转染HepG2细胞,48小时后收获细胞,提取总RNA并逆转录,通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术筛选出有效序列(pcDNA6.2-GW/EMG-FP mir-KDELC1 shRNA)。6.分析KDELC1表达变化对细胞周期的影响。分别利用pEGFP-C1-KDELC1和pcDNA6.2-GW/EMGFPmir-KDELC 1-shRNA载体,转染HepG2细胞,调节KDELC1的表达,利用流式细胞仪分析KDELC1高表达和低表达对细胞周期的影响。7.初步探讨KDELC1在内质网应激中的作用。利用衣霉素刺激HepG2细胞,建立细胞内质网应激模型。分别利用Western blot、real-time PCR法,检测内质网应激过程中KDELC1蛋白水平和mRNA水平的表达变化情况。8.初步探讨KDELC1在临床肝损伤中的作用。收集临床肝功能异常血清标本及正常对照血清标本,利用ELISA技术包被酶标板,采用上述制备的KDELC1多克隆抗体,分析该蛋白在肝损伤过程中可能的变化情况。结果1.成功获得KDELC1融合蛋白。人肝母细胞瘤细胞系HepG2经10%小牛血清DMEM培养36h后,Trizol法从HepG2细胞中提取总RNA。经RT-PCR扩增获得HepG2细胞cDNAo成功构建KDELC1的原核表达载体pET32a (+)-KDELC1,转化大肠杆菌E.coli BL21表达菌,经多次实验验证,确认终浓度为lmmol/L的IPTG、30℃、4h可诱导表达出KDELC1融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测确认。2.成功获得KDELC1的多克隆抗体。利用亲和层析柱,使用终浓度为1OmM咪唑的结合缓冲液,依次加50%,100%终浓度为150mM的咪唑结合缓冲液,50%,100%的500m M咪唑结合缓冲液洗脱层析柱,得到KDELC1的融合蛋白,经Western blot、SDS-PAGE验证。将所得KDELC1融合蛋白免疫新西兰大白兔5次,取其血清,使用蛋白A琼脂糖层析柱纯化KDELC1多克隆抗体,经Western blot检测证明该抗体有较好的特异性。3.成功构建KDELC1的细胞内定位载体。分别构建真核表达质粒pEGFP-C1-KDELC1、pERFP-calrrticulin-N1,经双酶切、测序鉴定后,共转染HepG2细胞。激光共聚焦显示pEGFP-C1-KDELC1与内质网居民蛋白calreticulin存在共定位现象。4.初步了解KDELC1在组织中的分布特征。利用免疫组织化学技术发现,KDELC1高表达于肝组织,弱表达于其他组织。胃、直肠以及喉组织较少表达；弱表达于肾小管,肾小球及系膜组织表达较弱。肺组织中度表达；淋巴结及脾脏高表达,主要表达于生发中心周围较成熟的淋巴细胞。5.成功构建、筛选出KDELC1的干扰质粒。通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术成功筛选出shRNA干扰质粒pcDNA6.2-GW/EMGFPmir-KDELC 1 shRNA(pcDNA6.2-KDELC1shRNA).6.KDELC1的表达变化参与调节细胞周期。流式细胞仪结果显示KDELC1表达质粒pEGFP-C1-KDELC 1转染后的HepG2细胞S期显著显著增加；而转染KDELC1 RNA干扰质粒pcDNA6.2-KDEL C1-RNAi-1后S期显著降低。7.KDELC1与内质网应激有关。在衣霉素诱导的内质网应激过程中,KDELC1在蛋白水平和mRNA水平表达基本一致,不同浓度的药物组之间蛋白表达无明显变化,但与非药物组相比,KDELC1的表达有较高程度的上调。8.KDELC1与临床肝损伤有关通过ELISA技术分析,结果表明KDELCl蛋白在肝功能异常组较正常组表达明显增高。结论1. KDELC1原核表达融合蛋白分子量75 kDa,免疫动物制备的KEDLC1的蛋白多克隆抗体具有较高的KEDLC1结合活性。2. KEDLC1与内质网居民蛋白calreticulin蛋白存在共定位关系,提示KEDLC1定位于内质网。3. KEDLC1在肝脏、肺、肾脏、脾脏、胃、乳腺、淋巴结、直肠组织中均有表达。4. KEDLC1参与调控细胞周期,高表达促进细胞增殖,低表达抑制细胞增殖。5.衣霉素诱导的内质网应激对该蛋白表达有明显影响,提示该蛋白可能与内质网应激有关。6. KDELC1蛋白可能诱导肝损伤发生。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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