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作者

焦凤萍

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

于爱莲

学位年度

2008

学位授予单位

泰山医学院

关键词

真核表达载体 抗原表位 噬菌体展示 酶联免疫吸附 疱疹病毒

分类号

R373;R392.11

摘要

目的： (1)用噬菌体展示技术筛选HSV-2gD的模拟抗原表位； (2)对筛选的结果应用生物信息学软件DNAStar protean进行蛋白质二级结构和B细胞抗原表位的分析，进一步确定HSV-2gD的模拟抗原表位； (3)构建人IL-18真核表达载体； (4)构建HSV-2gD模拟抗原表位的真核表达载体。 方法： (1)以HSV-2gD单克隆抗体作为固相筛选蛋白，对噬菌体12肽库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的生物筛选，挑取噬斑，用酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定阳性噬菌体克隆，提取阳性噬菌体的单链DNA，进行测序，并分析结果； (2)应用生物信息学软件DNAStar protean对筛选的结果进行蛋白质二级结构和B细胞抗原表位的分析，进一步确定HSV-2gD的模拟抗原表位； (3)TRIZOL法提取丙型肝炎病人肝脏组织的总RNA，应用TAKARA逆转录试剂盒将RNA逆转录成eDNA； (4)以pcDNA3.1-作为真核表达载体，应用DNAStar和Primer Pream软件设计两个目的基因的引物，即人IL-18和HSV-2gD模拟抗原表位； (5)应用PCR技术扩增目的基因：人IL...更多

目的： (1)用噬菌体展示技术筛选HSV-2gD的模拟抗原表位； (2)对筛选的结果应用生物信息学软件DNAStar protean进行蛋白质二级结构和B细胞抗原表位的分析，进一步确定HSV-2gD的模拟抗原表位； (3)构建人IL-18真核表达载体； (4)构建HSV-2gD模拟抗原表位的真核表达载体。 方法： (1)以HSV-2gD单克隆抗体作为固相筛选蛋白，对噬菌体12肽库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的生物筛选，挑取噬斑，用酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定阳性噬菌体克隆，提取阳性噬菌体的单链DNA，进行测序，并分析结果； (2)应用生物信息学软件DNAStar protean对筛选的结果进行蛋白质二级结构和B细胞抗原表位的分析，进一步确定HSV-2gD的模拟抗原表位； (3)TRIZOL法提取丙型肝炎病人肝脏组织的总RNA，应用TAKARA逆转录试剂盒将RNA逆转录成eDNA； (4)以pcDNA3.1-作为真核表达载体，应用DNAStar和Primer Pream软件设计两个目的基因的引物，即人IL-18和HSV-2gD模拟抗原表位； (5)应用PCR技术扩增目的基因：人IL-18和HSV-2gO模拟抗原表位，并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果； (6)应用基因工程技术将两个目的片段分别克隆到PMD-18 T simple vector中； (7)将两个目的基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1-中，构建DNA疫苗。 结果： (1)通过四轮特异性淘洗，筛选得到11个阳性噬菌体克隆，提取噬菌体单链DNA测序，从测序结果可以看出共有7个序列的同源性较高，其中有两个氨基酸基序即P*PLW和PYH**H出现的机率较高，可能为HSV-2gD的模拟抗原表位； (2)生物信息学软件分析两个氨基酸基序的代表：即短肽P3和P6，可以确定两者均具有形成模拟抗原表位的可能性； (3)成功扩增了两个目的片段：600bp左右大小的人IL-18和60bp左右大小的HSV-2gD模拟抗原表位P6； (4)将人IL-18与PMD-18 T simple vector连接成功。 结论：通过噬菌体展示技术，成功地筛选出了HSV-2gD的模拟抗原表位，经过生物信息学分析可以确定PYH**H和P*PLW都可能是HSV-2gD抗原模拟表位的基序；成功地获得了HSV-2gD模拟抗原表位P6的目的片段，并将人IL-18与T载体连接，为下一步实验奠定了基础。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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