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作者

孙函靓

学位名称

硕士

导师姓名

王昭金

学位年度

2020

学位授予单位

山东第一医科大学

关键词

肠易激综合征 降钙素基因相关肽 肥大细胞 内脏高敏感疼痛 NR4A3 蛋白激酶

分类号

R574

摘要

目的 肥大细胞通过释放各种炎症介质在肠易激综合征的发生和内脏高敏感性维持中发挥着重要作用。MCs常位于含有降钙素基因相关肽等神经肽的肠神经纤维附近，提示异常的神经免疫相互作用可能参与IBS病理生理过程。CGRP是一种重要的促炎神经肽，与受体结合，介导MCs活化和介质释放，参与肠内神经-MCs相互作用，与内脏高敏感疼痛密切相关。MCs己被证实有大量的CGRP受体表达。功能性CGRP受体包括三部分，降钙素受体样受体，受体活性修饰蛋白，以及受体组分蛋白，将受体与细胞信号通路结合，导致细胞内环磷酸腺苷和蛋白激酶A增加。IBS大鼠模型研究表明，靠近CGRP阳性神经纤维的结肠黏膜MCs数量明显增加。肠道感觉神经元源性CGRP可参与肠粘膜炎症调节或者直接通过受体介导参与肠粘膜MCs募集。这些CGRP-MCs相互作用可通过激活MCs和释放介质对神经源性炎症过程进行调节，提示CGRP可能参与IBS的病理生理过程。目前，虽然对CGRP受体在MCs表达以及参与IBS调控有一些研究，但CGRP对MCs的作用及其对IBS的调控机制尚不清楚。 NR4A3是一种转录因子，属于孤儿核受体家族成员之一，被激活后作用于靶...更多

目的 肥大细胞通过释放各种炎症介质在肠易激综合征的发生和内脏高敏感性维持中发挥着重要作用。MCs常位于含有降钙素基因相关肽等神经肽的肠神经纤维附近，提示异常的神经免疫相互作用可能参与IBS病理生理过程。CGRP是一种重要的促炎神经肽，与受体结合，介导MCs活化和介质释放，参与肠内神经-MCs相互作用，与内脏高敏感疼痛密切相关。MCs己被证实有大量的CGRP受体表达。功能性CGRP受体包括三部分，降钙素受体样受体，受体活性修饰蛋白，以及受体组分蛋白，将受体与细胞信号通路结合，导致细胞内环磷酸腺苷和蛋白激酶A增加。IBS大鼠模型研究表明，靠近CGRP阳性神经纤维的结肠黏膜MCs数量明显增加。肠道感觉神经元源性CGRP可参与肠粘膜炎症调节或者直接通过受体介导参与肠粘膜MCs募集。这些CGRP-MCs相互作用可通过激活MCs和释放介质对神经源性炎症过程进行调节，提示CGRP可能参与IBS的病理生理过程。目前，虽然对CGRP受体在MCs表达以及参与IBS调控有一些研究，但CGRP对MCs的作用及其对IBS的调控机制尚不清楚。 NR4A3是一种转录因子，属于孤儿核受体家族成员之一，被激活后作用于靶基因参与细胞周期、凋亡、炎症、代谢、DNA修复等调节。研究发现MCs活化后显著上调NR4A3的表达。该受体可调节MCs活化、趋化因子和细胞因子的分泌，是一种新的调节MCs功能的活性物质。但目前关于MCs活化上调NR4A3的分子机制以及在IBS病理生理机制中的作用并不清楚。本研究应用体外培养MCs结合内脏高敏感小鼠为模型，观察CGRP及其受体CRCP、RAMP1、CRLR对MCs活化的调节作用，并结合维甲酸诱导基因Ⅰ信号通路以探寻CGRP活化MCs上调NR4A3的分子机制；并观察CGRP阳性纤维，结肠MCs、RIG-Ⅰ和NR4A3在内脏高敏感小鼠的表达变化，希望这些研究能从分子水平上进一步了解CGRP参与IBS病理生理过程的调控机制，从而为IBS和内脏高敏感性疼痛的治疗提供新的靶点。 材料与方法 1.建立内脏高敏感小鼠模型。雄性C57BL/6小鼠采用慢性避水应激方法建立内脏高敏感动物模型，并通过以肠道转运能力评估为主的行为学观察方法和内脏敏感性评价为标准，筛选达标模型。 2.免疫组织化学技术结合荧光显微镜观察对照组和WAS实验组CGRP免疫阳性纤维，Tryptase阳性MCs以及CRCP、RAMP1、RIG-Ⅰ、NR4A3、NF-κB在小鼠结直肠MCs的表达变化；并观察CGRP免疫阳性纤维与Tryptase和NR4A3阳性标记MCs的相互关系。 3.CGRP孵育MCs0、1、2、4、6h，Westernbolt法检测CGRP对MCs表达RIG-Ⅰ、NF-κB、NR4A3、CRCP、iNOS、IFN-Ⅰ、HDAC2蛋白水平的影响。 4.CGRP与PKA、PKC激动剂与抑制剂共同孵育MCs1h，Westernblot法检测CGRP调节MCs表达RIG-Ⅰ、NR4A3、CRCP、NF-κB、Fos-b的分子机制。 5.将RIG-Ⅰ和CRCP的小干扰RNA分别转染MCs，Westernblot法检测CGRP调节MCs表达RIG-Ⅰ、CRCP、NR4A3、NF-κB、Fos-b的分子机制。 6.采用RTCA实时无标记细胞分析技术检测CGRP作用于MCs细胞株P815的细胞增殖曲线的变化，观察CGRP对MCs的细胞增殖与活性的影响。 结果 1.内脏高敏感小鼠动物模型的建立 与对照组相比，WAS组小鼠肠道转运能力增强，大便颗粒增多，体重减轻，腹部回缩反射评分升高，内脏敏感性升高并且稳定 2.WAS增加结肠CGRP阳性纤维和NR4A3阳性MCs的数量 与对照组相比，WAS组小鼠结直肠粘膜中CGRP阳性神经纤维和tryptase阳性MCs数量显著增多；大多数结直肠粘膜MCs靠近CGRP阳性神经纤维CGRP。此外，WAS组靠近CGRP阳性神经纤维的NR4A3标记MCs在结肠粘膜中的数量显著增加。 3.WAS增加CGRP受体和RIG-Ⅰ在结肠黏膜MCs的表达 免疫荧光双重标记显示，与对照组相比，WAS组小鼠结肠黏膜CRLR、RAMP1和CRCP与tryptase双标MCs在小鼠结肠黏膜数量较多，三种受体组分蛋白阳性的MCs数量在WAS组显著高于对照组。另外，与对照组比较，WAS组结直肠粘膜RIG-Ⅰ表达阳性的MCs数量显著增加。 4.CGRP经PKA/PKC信号通路上调MCs表达NR4A3、RIG-Ⅰ和NF-κB Westernblot结果显示，CGRP刺激MCs0，1，2，4，6h可显著上调MCs中NR4A3、RIG-Ⅰ和NF-κB蛋白表达水平，且随着CGRP刺激时间的增加而增加蛋白表达水平。与CGRP组比较，PKA/PKC激动剂增强CGRP对NR4A3、RIG-Ⅰ和NF-κB表达的上调作用，而PKA/PKC抑制剂则部分或完全阻断CGRP对NR4A3、RIG-Ⅰ和NF-κB表达的上调作用。单独应用PKA/PKC激动剂或抑制剂没有作用。 5.CRCP和RIG-Ⅰ基因敲除抑制CGRP上调MCs表达NR4A3 应用Westernblot检测CRCP/RIG-Ⅰ基因沉默对CGRP诱导MCs表达NR4A3的影响。转染CRCP-siRNA或RIG-Ⅰ-siRNA后，CGRP刺激60min。与CGRP组比较，CRCP基因敲除抑制CGRP对RIG-Ⅰ、NR4A3、Fos-b表达的上调作用，而RIG-Ⅰ基因敲除抑制CGRP对NR4A3表达的上调作用，对CRCP没有影响。说明CGRP可能经CRCP/RIG-Ⅰ途径上调NR4A3表达。 6.CGRP对MCs细胞增殖和活性的影响 RTCA增殖试验表明，CGRP刺激MCs后细胞指数呈时间依赖性增加，CGRP刺激24h后CGRP组细胞指数明显高于对照组。 结论 1.WAS小鼠结肠CGRP阳性纤维和NR4A3阳性MCs数量显著增加，且大多数NR4A3阳性MCs位于CGRP阳性神经纤维附近，说明CGRP和NR4A3表达可能对内脏高敏感性疼痛的调控存在相互作用。 2.CGRP上调MCs表达NR4A3和RIG-Ⅰ，结合WAS增加小鼠结肠黏膜MCs表达CGRP受体CRCP、RAMP1、CRLR，以及NR4A3和RIG-Ⅰ，说明CGRP可能通过影响MCs表达NR4A3和RIG-Ⅰ参与内脏高敏感疼痛调控，其机制可能与PKA/PKC信号通路有关。 3.CRCP和RIG-Ⅰ基因敲除抑制CGRP上调MCs表达NR4A3，说明CGRP可能经CRCP/RIG-Ⅰ上调NR4A3表达，参与MCs活化和功能调控。 4.RTCA增殖试验显示CGRP增加MCs细胞增殖指数，结合CGRP增加MCs表达tryptase，表明CGRP可能促进MCs活化、分裂、增殖。上述结果说明CGRP可能通过上调MCs表达NR4A3参与内脏高敏感性疼痛的调控。该分子有可能成为IBS临床治疗的可能靶点。收起

文献类型

学位论文

浏览量

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