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作者

刘帅

学位名称

硕士

导师姓名

秦树存

学位年度

2013

学位授予单位

泰山医学院

关键词

磷脂转运蛋白 炎症 核转录因子κB 基因敲除小鼠

摘要

目的炎症(inflammation)在人类多种重要疾病的发生和发展过程中起着关键的作用。巨噬细胞(macrophage)作为一种免疫细胞，在炎症的多个环节起到重要作用。核转录因子κB(nucleus factor kappa-B, NFκB)是巨噬细胞参与的炎症信号通路中最重要的转录因子之一，它的激活能引起多种炎症因子如白细胞介素(interleukin)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等表达升高。磷脂转运蛋白(phospholipidtransfer protein, PLTP)参与炎症发生发展过程，PLTP能结合、转运以及中和脂多糖(lip-polysaccharide, LPS)，PLTP缺乏小鼠(PLTP-/-)在致死剂量的内毒素血症时血浆炎症因子表达升高，器官损伤加重，死亡率增加。该过程中高表达的炎症因子均受NFκB调控，且在巨噬细胞内均有表达，提示上述炎症因子表达升高很可能与巨噬细胞NFκB激活相关。本研究拟采用多种巨噬细胞为模型，探讨PLTP低表达或不表达对LPS刺激的影响及可能的分子机制。方法1、小鼠繁育，PLTP敲除杂合...更多

目的炎症(inflammation)在人类多种重要疾病的发生和发展过程中起着关键的作用。巨噬细胞(macrophage)作为一种免疫细胞，在炎症的多个环节起到重要作用。核转录因子κB(nucleus factor kappa-B, NFκB)是巨噬细胞参与的炎症信号通路中最重要的转录因子之一，它的激活能引起多种炎症因子如白细胞介素(interleukin)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等表达升高。磷脂转运蛋白(phospholipidtransfer protein, PLTP)参与炎症发生发展过程，PLTP能结合、转运以及中和脂多糖(lip-polysaccharide, LPS)，PLTP缺乏小鼠(PLTP-/-)在致死剂量的内毒素血症时血浆炎症因子表达升高，器官损伤加重，死亡率增加。该过程中高表达的炎症因子均受NFκB调控，且在巨噬细胞内均有表达，提示上述炎症因子表达升高很可能与巨噬细胞NFκB激活相关。本研究拟采用多种巨噬细胞为模型，探讨PLTP低表达或不表达对LPS刺激的影响及可能的分子机制。方法1、小鼠繁育，PLTP敲除杂合子为亲代，繁育出子代经基因型鉴定得到纯合子PLTP-/-及同窝出生野生型小鼠(wild type mic, WT)。从中选取雄性WT和PLTP-/-各8只。2、小鼠第八周龄时，提取LPS诱导的腹腔巨噬细胞，分离骨髓进行原代培养，并添加含集落刺激因子的L cell培养基进行诱导。培养十天左右，骨髓源性巨噬细胞(bone marrow derived macrophage, BMDM)诱导完成。3、培养巨噬细胞模型RAW264.7、人脐静脉上皮细胞(Human umbilicalvein epithelial cell, HUVEC)，分为三组分别为空白组(标记为blank)、对照组(标记为Control siRNA)和实验组(标记为PLTP siRNA)。4、将WT和PLTP-/-BMDM两种细胞分别在不同的时间段(分别为0.5h,1h,2h)给予LPS(浓度为200ng/ml)刺激。5、将PLTP siRNA RAW264.7在不同的时间段(分别为0.5h,1h,2h)给予LPS(浓度为200ng/ml)刺激。6、将PLTP siRNA HUVEC在不同的时间段(分别为0.5h,1h,2h)给予TNF-α(浓度为20ng/ml)刺激。7、Western Blot检测与NFκB信号通路相关蛋白；NFκB活性亚单位p65、胞浆内抑制亚单位IκB-α、信号转导及转录激活因子3(Signal transducers and activators oftranscription3, STAT3)及其磷酸化蛋白(pSTAT3)、转录生长因子激酶1(transformgrowth factor activated kinase1, TAK1)及其磷酸化蛋白(pTAK1)，核蛋白内参H3以及胞浆蛋白内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)。8、实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)技术检测细胞中相关炎症因子IL-6、 IL-10、 TNF-α和干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)mRNA的表达。9、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay)检测BNDM培养基中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量。10、免疫荧光染色技术检测核蛋白p65转位。结果1、LPS刺激下腹腔巨噬细胞及原代巨噬细胞炎症因子表达的实验结果；(1)PLTP-/-腹腔巨噬细胞炎症因子IL-10、IFN-γ、TNF-α和IL-6的mRNA的表达均较WT显著升高(P0.05)。(3)PLTP-/-BMDM培养基中炎症因子表达较WT均有所升高： IL-10和TNF-α升高198.5℅(P0.05)。2、 LPS刺激下WT和PLTP-/-BMDM及LPS刺激下PLTP konckdownRAW264.7p65和IκB-α结果；(1)BMDM核内p65含量， PLTP-/-较WT增加30.5℅(P<0.05)。(2)BMDM胞浆内IκB-α含量， PLTP-/-较WT减少34℅(P<0.05)。(3)RAW264.7核内p65含量， PLTP siRNA组较control siRNA组增加200℅(P<0.05)。(4)RAW264.7胞浆内IκB-α含量，PLTP siRNA组较control siRNA组减少43℅(P<0.02)。3、 TNF-α诱导的HUVEC p65和IκB-α结果(1)HUVEC核内p65含量， PLTP siRNA组较Control siRNA组增加54℅(P<0.05)。(2)HUVEC胞浆内IκB-α含量，PLTP siRNA组较Control siRNA组减少351.2℅(P<0.05)。4、 LPS刺激下PLTP konckdown RAW264.7细胞120min和TNF-α刺激的PLTP konckdown HUVEC细胞120min时， pTAK1和TAK1蛋白表达结果；(1)在PLTP knockdown RAW264.7细胞中PLTP siRNA组较siRNA组在120min时增加了150℅(P<0.05)。(2)在PLTP knockdown HUVEC细胞中， PLTP siRNA组较siRNA组在120min时增加了3倍(P<=0.05)5、在加入格列苯脲后LPS诱导WT和PLTP-/-BMDM60min时pSTAT3蛋白结果；在PLTP存在的情况下，pSTAT3的核内水平未发现明显增加，说明在本实验中未观察到由巨噬细胞自身分泌的PLTP激活ABCA1-pSTAT3的现象。6、 LPS诱导的WT和PLTP-/-BMDM、 LPS诱导的PLTP knockdownRAW264.7细胞和TNF-α诱导的PLTP konckdown RAW264.7细胞免疫荧光染色结果；(1)PLTP-/-BMDM较WT BMDM p65核转位明显增加。(2)LPS诱导的RAW264.7细胞PLTP siRNA组较control siRNA组明显增加。(3)TNF-α诱导的HUVEC细胞PLTP siRNA组较control siRNA组明显增加。结论(1)PLTP缺乏诱导的PDM和BMDM在LPS刺激下炎症因子表达升高。(2)PLTP缺乏增强了NFκB活性亚单位p65核转位水平。(3)RAW264.7和HUVEC中NFκB活性亚单位p65核转位水平增强可能与TAK1磷酸化作用有关收起

文献类型

学位论文

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