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作者

刘莉

作者单位

泰山医学院

学位名称

硕士

导师姓名

于爱莲，王玉

学位年度

2010

学位授予单位

泰山医学院

关键词

HSV-2 gD 模拟抗原表位 IL-18 DNA重组疫苗

分类号

R392

摘要

根据前期筛选的人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白gD模拟抗原表位序列P6,选取与其最相近的天然抗原表位序列NP6(Accession Number:E00394),以pcDNA3.1(-)为载体、hIL-18为佐剂,分别构建和表达HSVP6和HSV NP6与IL-18不同串联组合的重组表达克隆,并探讨其诱导小鼠机体免疫应答的能力。方法(1)采用串联简并引物PCR法将P6和NP6(与P6最相近的天然抗原表位序列)与hIL-18基因序列分不同组合串联克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组克隆pcDNA3.1-IL-18-HSVP6、pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6、pcDNA3.1-IL-18,并经双酶切、测序鉴定后将各重组质粒分别转染CHO细胞,通过P6合成多肽免疫家兔阳性血清介导的间接免疫荧光法、Western blotting检测P6和NP6的表达情况；(2)6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为6组(每组10只),于小鼠双侧股四头肌注射免疫,根据质粒的注射类型不同,各组依次为：1组每侧各注射NS(生理盐水)100μl,2组每侧各注射空载体质粒pcDNA3....更多

根据前期筛选的人单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白gD模拟抗原表位序列P6,选取与其最相近的天然抗原表位序列NP6(Accession Number:E00394),以pcDNA3.1(-)为载体、hIL-18为佐剂,分别构建和表达HSVP6和HSV NP6与IL-18不同串联组合的重组表达克隆,并探讨其诱导小鼠机体免疫应答的能力。方法(1)采用串联简并引物PCR法将P6和NP6(与P6最相近的天然抗原表位序列)与hIL-18基因序列分不同组合串联克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组克隆pcDNA3.1-IL-18-HSVP6、pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6、pcDNA3.1-IL-18,并经双酶切、测序鉴定后将各重组质粒分别转染CHO细胞,通过P6合成多肽免疫家兔阳性血清介导的间接免疫荧光法、Western blotting检测P6和NP6的表达情况；(2)6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为6组(每组10只),于小鼠双侧股四头肌注射免疫,根据质粒的注射类型不同,各组依次为：1组每侧各注射NS(生理盐水)100μl,2组每侧各注射空载体质粒pcDNA3.1 100μl(1 mg/ml),3组每侧各注射重组质粒pcDNA3.1-IL-18100μl (1 mg/ml),4组每侧各注射P6合成多肽100μl (1mg/ml),5组每侧各注射重组质粒pcDNA3.1-IL-18-HSV P6 100μl(1mg/ml),6组每侧各注射重组质粒pcDNA3.1-IL-18-HSVNP6100μl(1 mg/ml).连续免疫三次,每次间隔一周,首次免疫应用弗式完全佐剂与注射质粒1：1混合,以加强免疫效果。小鼠于免疫完成后1周眼眶内眦静脉取血,间接ELISA法检测血清IgG. IFN-y及IL-18表达量,免疫完成后4周断颈处死小鼠,取小鼠脾淋巴细胞,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖率。结果(1)构建的串联重组克隆pcDNA3.1-IL-18-HSV P6、pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6、pcDNA3.1-IL-18经双酶切及测序鉴定插入序列正确,经间接免疫荧光、Western blotting检测均可证实串联重组克隆pcDNA3.1-IL-18-HSVP6中模拟抗原表位序列P6具有免疫原性,质粒构建成功；(2)免疫小鼠后实验结果显示：串联重组克隆pcDNA3.1-IL-18-P6无论是在体液免疫还是在细胞免疫方面,免疫效果均优于其他实验组,能够较好的诱导体液免疫和细胞免疫应答。结论(1)用串联简并引物PCR法成功构建和表达了重组质粒pcDNA3.1-IL-18-HSV P6、pcDNA3.1-IL-18-HSV NP6和pcDNA3.1-IL-18;(2)体内免疫试验证实本研究构建的串联重组克隆pcDNA3.1-IL-18-P6能有效诱导小鼠体液免疫和细胞免疫应答。收起

学科

【教育部学科】医学

文献类型

学位论文

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