pRluc-KOR真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

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摘要: 目的:构建与海肾萤光素酶(Rluc)融合的κ型阿片受体(KOR)真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法(BRET)检测apelin受体和KOR之间的相互作用.方法:以质粒pcDNA3.1-KOR为模板,PCR方法扩增KOR.扩增的KOR用NotⅠ和XhoⅠ双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒pRluc.将这两种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10.挑取菌落培养,提取质粒,行酶切鉴定及测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(HEK293)细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察.结果:扩增出了1条1143 bp的片段,与预期的KOR大小相符,质粒酶切结果显示pRluc-KOR被切成2条片段,其中一条为pRluc载体大小,另一条为目的片段大小.经测序鉴定,序列与GenBank(NM_000912)中的序列高度同源.共聚焦显微镜观察显示,阿片受体主要表达在细胞膜上.结论:构建成功了pRluc-KOR重组表达载体,此表达载体可用于检测KOR与apelin受体或与其他受体之间的相互作用.

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