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作者

李雅林 白波 陈京 刘有旺 杜辉 刘海青 于鹏丽

作者单位

济宁医学院 山东农业大学生命科学学院 泰山医学院神经生物学实验室

刊名

中华临床免疫和变态反应杂志

年份

2009

卷号

第4期

ISSN

1673-8705

关键词

apelin受体 真核表达载体 HEK293细胞

分类号

R335

摘要

目的 构建与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGEP)融合的人apelin受体(Apelin receptor,apelin-R)真核表达载体.方法 以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人apelin受体.扩增的人apelin受体用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒peGFP-C1.然后将两种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10.挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney 293,HEK293)细胞,共聚焦显微镜观察.提取转染细胞的总蛋白,进行Western blot检测.结果 扩增出一条约1 200bp的片段,与预期的apelin受体大小相符.酶切结果显示,重组质粒pEGFP-hApelin-R被切成两条片段,其中一条为peGFP-C1载体大小,另一条为目的 片段大小.经测序鉴定,序列与GenBank(NM_005161)中的序列高度同源.共聚焦显微镜观察显示,人a...更多

目的 构建与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGEP)融合的人apelin受体(Apelin receptor,apelin-R)真核表达载体.方法 以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人apelin受体.扩增的人apelin受体用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,同时用这两种酶双酶切质粒peGFP-C1.然后将两种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10.挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾(human embryonic kidney 293,HEK293)细胞,共聚焦显微镜观察.提取转染细胞的总蛋白,进行Western blot检测.结果 扩增出一条约1 200bp的片段,与预期的apelin受体大小相符.酶切结果显示,重组质粒pEGFP-hApelin-R被切成两条片段,其中一条为peGFP-C1载体大小,另一条为目的 片段大小.经测序鉴定,序列与GenBank(NM_005161)中的序列高度同源.共聚焦显微镜观察显示,人apelin受体主要在细胞膜上表达.Western blot结果显示在相对分子质量69 000处有一蛋白条带,与预期大小相符.结论 构建成功pEGFP-hApelin-R重组表达载体,此表达载体可用于检测apelin受体和κ型阿片受体(kappa opioid receptor,KOR)或与其他受体间的相互作用.收起

基金

国家自然科学基金;山东省自然科学基金

学科

【教育部学科】医学

文献类型

期刊

浏览量

20